甲狀腺癌中BRAF、RET、MEN1、FOXE1等基因相關(guān)SNP位點(diǎn)的篩選及臨床價(jià)值＊

朱曉娥，袁耿彪△，范永增，冉海濤，鄭元義，王志剛

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所 400010）

甲狀腺癌中BRAF、RET、MEN1、FOXE1等基因相關(guān)SNP位點(diǎn)的篩選及臨床價(jià)值＊

朱曉娥1，袁耿彪1△，范永增1，冉海濤2，鄭元義2，王志剛2

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所 400010）

目的分析甲狀腺癌（TC）BRAF、RET、MEN1、FOXE1等14個(gè)基因的80個(gè)SNP突變位點(diǎn)，探討TC的發(fā)病機(jī)制及潛在的臨床診斷、治療和預(yù)防干預(yù)價(jià)值。方法根據(jù)2011年12月前更新的納入標(biāo)準(zhǔn)，納入文獻(xiàn)77篇，篩選出14個(gè)基因共80個(gè)高信息量的SNP位點(diǎn)。采集8例乳頭狀甲狀腺癌（PTC）、2例濾泡狀甲狀腺癌（FTC）、1例未分化癌（pDTC），共11例腫瘤組織樣本，分別取腫瘤組織、瘤旁組織，以及甲狀腺良性腫瘤（TA）組織標(biāo)本22例。采用DNA純化試劑盒提取組織DNA，80個(gè)SNP位點(diǎn)采用Sequenom Mass ARRAY?相對(duì)分子質(zhì)量陣列技術(shù)進(jìn)行序列分析，并采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果。結(jié)果（1）選擇14個(gè)基因的80個(gè)位點(diǎn)，除了BRAF的rs1733832位點(diǎn)在樣本中未檢出，其余79個(gè)位點(diǎn)在TC、TC癌旁組織及TA中都有表達(dá)；（2）MEN1基因的rs669976位點(diǎn)和FOXE1基因的rs965513位點(diǎn)的突變?cè)赥C和TA中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（3）TP53基因的rs722494在TC及TC癌旁的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（4）80個(gè)SNP位點(diǎn)在PTC中有47.5%的位點(diǎn)出現(xiàn)融合型，2.5%的位點(diǎn)出現(xiàn)缺失；在FTC中，有7.5%的位點(diǎn)出現(xiàn)融合型，1.25%的位點(diǎn)出現(xiàn)缺失。結(jié)論TC相關(guān)14個(gè)基因?qū)C的發(fā)生、發(fā)展及良惡性鑒別起到重要作用，為進(jìn)一步對(duì)TC復(fù)發(fā)／轉(zhuǎn)移、失分化的診斷、治療、預(yù)防干預(yù)及分子靶向抑制劑的應(yīng)用提供了研究的方向和潛在的臨床診斷、治療價(jià)值。

甲狀腺腫瘤；多態(tài)性，單核苷酸；基因分型

近20年來(lái)，中國(guó)的甲狀腺癌（TC）發(fā)病率呈上升趨勢(shì)；但近幾年，隨著TC規(guī)范性診療指南的推廣與應(yīng)用，降低了TC的復(fù)發(fā)／轉(zhuǎn)移率和病死率，提高了患者生存率，但對(duì)于部分的復(fù)發(fā)／轉(zhuǎn)移或者失分化的TC，目前仍未有特異性的診斷和治療手段。目前，已證明有多種癌基因、抑癌基因與TC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在TC細(xì)胞的惡性增殖、轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及對(duì)放、化療的拮抗起著重要作用。因此，采用快速、高效率、高通量處理TC相關(guān)基因的多個(gè)SNP位點(diǎn)，有助于了解不同個(gè)體基因的表型差異，不同群體對(duì)疾病的易感性，不同病理分型對(duì)藥物的耐性以及患者對(duì)不同環(huán)境反應(yīng)的差異［1］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年6月至2011年11月本院術(shù)后確診為TC的患者11例，平均年齡（50.73±8.69）歲；其中乳頭狀甲狀腺癌（PTC）8例，濾泡狀甲狀腺癌（FTC）2例，未分化癌（pDTC）1例，包括7組同一個(gè)患者的配對(duì)TC及癌旁組織，其中有4組PTC，1組pDTC，2組FTC；術(shù)后病理確診甲狀腺良性腫瘤（TA）患者22例，年齡23～80歲，平均（47.61±13.42）歲，包括18例濾泡性甲狀腺腺瘤，2例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，1例亞甲炎，1例甲狀腺纖維腺瘤。新鮮組織樣本采取離體后30min內(nèi)速凍與液氮，48h后移入－80°冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 采用美國(guó)Promega公司DNA提取試劑盒，SNP分型檢測(cè)的主要試劑來(lái)自美國(guó)Sequenom公司的iPLEX?Gold Reagent Kit試劑盒，所有引物均在上海英駿生物公司合成，質(zhì)譜檢測(cè)及分析使用Sequenom公司Mass ARRAY Analyzer Compact系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA提取 采用DNA試劑盒提取組織中的DNA，用分光光度計(jì)定量，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢。質(zhì)檢合格的DNA將濃度調(diào)整到50ηg／μL，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 采用Sequenom公司Genotyping Tools及Mass ARRAY Assay Design軟件設(shè)計(jì)，待測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，由上海英駿生物公司合成。

1.3.3 SNP位點(diǎn)篩選 根據(jù)NCBI、OMIM和KEGG網(wǎng)站所公布的基因和SCI收錄和公開發(fā)表的文獻(xiàn)及納入標(biāo)準(zhǔn)，篩選出14個(gè)基因共80個(gè)高信息量的SNP位點(diǎn)。其中PTC:BRAF及RET 2個(gè)基因36個(gè)位點(diǎn)，F(xiàn)TC的RAS及PAX8－PPARγ2個(gè)基因7個(gè) 位點(diǎn)，pDTC的TP53和CTNNB1 2個(gè)基因的26個(gè)位點(diǎn)，及其他8個(gè)相關(guān)基因的11個(gè)位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果，80個(gè)SNP位點(diǎn)采用Sequenom Mass ARRAY?相對(duì)分子質(zhì)量陣列技術(shù)進(jìn)行序列分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA樣本提取結(jié)果 質(zhì)檢后共計(jì)11例TC及癌旁組織，其中有7組配對(duì)，4例未配對(duì)（圖1）；余22例TA質(zhì)檢合格（圖2）。

2.2 80個(gè)SNP位點(diǎn)在TC與TA的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 80個(gè)TC相關(guān)的SNP位點(diǎn)，其中除了BRAF基因的rs1733832在所有病例中均未檢出外，其余79個(gè)SNP位點(diǎn)在TC及TA中均有突變。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，多發(fā)性內(nèi)分泌瘤1型（MEN1）基因的rs669976（T＞C）與甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子2（FOXE1）基因的rs965513（G＞A）在TC與TA間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 MEN1基因的rs669976位點(diǎn)的飛行質(zhì)譜圖 rs669976在縱軸質(zhì)量為6215和6220的位置分別為等位位點(diǎn)T和C（圖3、4，橫坐標(biāo)為強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為質(zhì)量）；圖3是TC，位點(diǎn)C有離子峰，位點(diǎn)T沒有峰；圖4是TA，正好相反，位點(diǎn)C沒有峰，位點(diǎn)T出現(xiàn)峰。

圖1 11例TC及癌旁組織DNA電泳

2.4 79個(gè)位點(diǎn)在7組TC及癌旁組織中的結(jié)果 7組TC及癌旁組織包括4組PTC，其中1組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；1組pDTC，2組FTC。79個(gè)SNP位點(diǎn)中有4個(gè)位點(diǎn)在其中5組樣本的癌及癌旁組織中的基因型有顯著性差異（表1）。TP53基因的rs722494在3組PTC、2組FTC及1組pDTC的癌組織中表現(xiàn)為GC堿基融合；TP53基因的rs1794287在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC癌組織及FTC中表現(xiàn)為C堿基缺失；MEN1基因的rs607969在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC中表現(xiàn)為堿基的缺失；BRAF的rs17623382在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC中表現(xiàn)為GT堿基的融合。

圖2 TA組織DNA電泳

圖3 rs669976在TC中的飛行質(zhì)譜

圖4 rs669976在TA中的飛行質(zhì)譜

表1 7組TC及癌旁組織中的4個(gè)SNP的突變情況（%）

表2 80個(gè)SNP位點(diǎn)在11個(gè)非配對(duì)TC樣本中的分型比例（%）

續(xù)表2 80個(gè)SNP位點(diǎn)在11個(gè)非配對(duì)TC樣本中的分型比例（%）

2.5 80個(gè)SNP位點(diǎn)在11個(gè)非配對(duì)TC中的基因分型情況本研究分別篩選了與TC相關(guān)的80個(gè)SNP位點(diǎn)，在PTC中有47.5%的位點(diǎn)出現(xiàn)雜合型，2.5%的位點(diǎn)出現(xiàn)缺失；在FTC中，有7.5%的位點(diǎn)出現(xiàn)雜合型，1.25%的位點(diǎn)出現(xiàn)缺失；在pDTC中有8.75%的位點(diǎn)出現(xiàn)雜合型，未見位點(diǎn)缺失。14個(gè)基因在PTC、FTC和pDTC的分型出現(xiàn)率，見表2。

3 討 論

TC起病較隱匿，生物學(xué)特征多變，故鑒別診斷困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和人類對(duì)TC發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，基因片段診斷及治療逐漸成為腫瘤生物學(xué)的重要組成部分［2］。

3.1 PTC 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，MAPK的持續(xù)磷酸化或激活對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要，可導(dǎo)致PTC細(xì)胞表型改變［3］。BRAF是MARK信號(hào)通路的關(guān)鍵成分，當(dāng)其發(fā)生改變時(shí)可能導(dǎo)致腫瘤形成［4］。RET基因?qū)儆阝}黏著蛋白，編碼跨膜酪氨酸激酶受體，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起著轉(zhuǎn)換信號(hào)調(diào)節(jié)的作用。本研究中，BRAF基因的21個(gè)SNP位點(diǎn)不僅有單堿基型，還有雜合型，與文獻(xiàn)報(bào)道該基因是PTC最常見的遺傳突變相符，BRAF基因的rs17623382在TC與TA的基因分型中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與TC的病理組織分型、基因檢測(cè)方法、病例數(shù)以及地域、民族等因素有關(guān)。目前，未見文獻(xiàn)報(bào)道BRAF基因分型對(duì)于PTC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用。本研究表明，rs17623382位點(diǎn)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC癌旁組織中有不同的基因分型，但是否可為臨床早期診斷PTC的轉(zhuǎn)移提供依據(jù)，還有待進(jìn)一步的研究。Cheung等［5］研究表 明，RET 基因rs1799939位點(diǎn)的多態(tài)性與耐藥性有關(guān)，基因分型與TC形成的輻射劑量有關(guān)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，RET基因與TC的病理分型可能有關(guān)，如何將RET的基因分型與TC的形成機(jī)制及耐藥性結(jié)合起來(lái)，還有待研究。

3.2 FTC 由于FTC的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與生物學(xué)行為的差異，易與甲狀腺濾泡狀腺瘤鑒別混淆。FTC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前，文獻(xiàn)主要報(bào)道了PPAR信號(hào)通路在FTC的形成機(jī)制中的作用，主要包括了RAS、PAX8－PPARG等基因。RAS基因是一種原癌基因，調(diào)控細(xì)胞外信號(hào)應(yīng)答，細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程。RAS基因家族中包括很多亞型，熱點(diǎn)亞型最主要在HRAS、NRAS及KRAS，他們?cè)贔TC、PTC、間變性癌和濾泡狀腺瘤中的突變率也大致相同［7］。本研究中，HRAS、NRAS、KRAS基因的位點(diǎn)在TC和TA中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與所選的病例太少有關(guān)；其中HRAS基因的rs12628位點(diǎn)的基因分型可以為TC的病理分型提供一定的臨床價(jià)值，用于早期診斷和治療。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，在PAX8－PPARγ陽(yáng)性的FTC中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞代謝、血管生長(zhǎng)、信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯調(diào)控等相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)［8］。PAX8－PPARγ基因重排在FTC中的表達(dá)率較高，也見于小部分的TA，這種表達(dá)上的差異可能與多種因素有關(guān)［9］。本研究顯示，rs1478、rs13073869、rs3856806及rs1801282在FTC中表現(xiàn)為單基因型，而在PTC中有雜合型；在TC和TA中，等位位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與收集的TA大多數(shù)為濾泡性腺瘤有關(guān)，說(shuō)明PAX8－PPARγ基因重排在鑒別濾泡性甲狀腺腫瘤的良、惡性上，還有待進(jìn)一步研究。

3.3 pDTC TP53的突變體在不同人群的癌癥中都經(jīng)常發(fā)生，但并沒有對(duì)基因的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)成共識(shí)。有報(bào)道稱，p53基因突變可以加劇分化型TC向pDTC［10］。本實(shí)驗(yàn)中篩選的TP53基因21個(gè)SNP位點(diǎn)，融合突變發(fā)生率在PTC較高，在FTC較低，在pDTC中沒有；而缺失在PTC和FTC概率一致；說(shuō)明TP53的基因分型與TC的病理類型有一定的相關(guān)性，對(duì)于低分化腺癌形成機(jī)制的研究有幫助，故TP53抑癌基因可以作為分子診斷靶向工具。CDH1、CTNNB1基因都屬于鈣粘連蛋白的一種，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起了一定的作用。近期文獻(xiàn)提到了CTNNB1基因及其編碼的鈣粘連蛋白與TC之間有著密切的關(guān)系［11］。CDH1基因突變導(dǎo)致該基因功能的缺失，影響著腫瘤的生長(zhǎng)增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［12］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)CTNNB1基因的5個(gè)位點(diǎn)和CDH1基因的2個(gè)位點(diǎn)在PTC中都有堿基的雜合型，CDH1基因在FTC僅有一個(gè)出現(xiàn)雜合，在pDTC均為單堿基型。說(shuō)明這兩種鈣粘連蛋白基因與pDTC的形成機(jī)制有關(guān)。

3.4 其他與TC相關(guān)的基因 FOXE1基因的rs1867277是TC形成的易感因素之一，rs965513與PTC形成的放射性環(huán)境有關(guān)。本研究中，F(xiàn)OXE1基因的rs965513在TC及TA的基因分型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雖然文獻(xiàn)未報(bào)道rs1443434在TC中的作用，但本研究證實(shí)了其在PTC中出現(xiàn)了融合型，說(shuō)明它對(duì)于TC的發(fā)生、發(fā)展起到一定作用。MEN1基因?yàn)橐环N新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，它的突變和缺失，導(dǎo)致其編碼蛋白的失活。國(guó)外文獻(xiàn)稱，MEN1基因與遺傳性TC的形成有一定的相關(guān)性。本研究選擇MEN1基因的rs607969位點(diǎn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一組PTC組織表現(xiàn)為堿基的缺失，而在癌旁組織中表現(xiàn)為堿基的雜合，是否可以用rs607969位點(diǎn)作為鑒別PTC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的手段，還有待于進(jìn)一步研究。NKX2－1最初被發(fā)現(xiàn)也是屬于甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子的一種，其編碼的蛋白質(zhì)與甲狀腺球蛋白的啟動(dòng)有關(guān)，并調(diào)節(jié)甲狀腺的生長(zhǎng)發(fā)生和基因表達(dá)，尤其是rs944289在TC的病理分型、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及放射性環(huán)境的影響中的作用。

綜上所述，與TC相關(guān)的SNP，既有與TC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的，也有與TC形成的放射性環(huán)境相關(guān)的，還有與TC抗腫瘤藥物的耐藥性相關(guān)的，采取大通量、高速、快捷的篩選TC相關(guān)SNP位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是可行的，可以建立有效的預(yù)警系統(tǒng)，達(dá)到一級(jí)防預(yù)目的。

［1］朱曉娥，袁耿彪.基因芯片技術(shù)在基因突變?cè)\斷中的應(yīng)用及其前景［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（22）:3128－3131.

［2］袁耿彪.甲狀腺癌腫的基因突變及其在診斷治療中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2009，16（3）:1－5.

［3］Syvanen AC.Accessing genetic variation:genotyping single nucleotide polymorphisms［J］.Nat Rev Genet，2001，2（12）:930－942.

［4］Engelberg D.Stress－activated protein kinases－tumor suppressors or tumor initiators［J］.Semin Cancer Biol，2004，14（4）:271－282.

［5］Cheung CC，Ezzat S，F(xiàn)reeman JL，et al.Lmmunohistochemical diagnosis of papillary thyroid carcinoma［J］.Mod Pathol，2001，14（4）:338－342.

［6］Sigurdsona AJ，Landa CE，Bhatti P，et al.Thyroid nodules，polymorphic variants in DNA repair and RETrelated genes，and interaction with ionizing radiation exposure from nuclear tests in Kazakhstan［J］.Radiat Res，2009，171（1）:77－88.

［7］Lang BH，Lo CY，Chan WF，et al.Staging systems for follicular thyroid carcinoma:application to 171consecutive patients treated in a tertiary referral centre［J］.Endocr Relat Cancer，2007，14（11）:29－42.

［8］Kondo T，Ezzat S，Asa SL.Pathogenetic mechanisms in thyroid follicular－cell neoplasia［J］.Nat Rev Cancer，2006，6（4）:292－306.

［9］Castro P，Reboeho AP，Snares RJ，et al.PAX8－PPAR－gamma rearrangement is frequently detected in the follicular variant of papillary thyroid carcinoma［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91（1）:213－220.

［10］Kroll TG，Sarraf P，Pecciarini L，et al.PAX8－PPARgammal fusion oncogene in human thyroid carcinoma［corrected］［J］.Science，2000，289（5483）:1357－1360.

［11］Namba H，Yamashita S.Gene abnormalities in thyroid cancer［J］.Nippon Rinsho，2007，65（11）:1967－1972.

［12］Tartari CJ，Donadoni C，Manieri E，et al.Dissection of the RET／β－catenin interaction in the TPC1thyroid cancer cell line［J］.Am J Cancer Res，2011，1（6）:716－725.

Selection and clinical value of 80 SNP loci from BRAF，RET，MEN1，F(xiàn)OXE1，etc in thyroid neoplasms＊

Zhu Xiao′e1，Yuan Gengbiao1△，F(xiàn)an Yongzeng1，Ran Haitao2，Zheng Yuanyi2，Wang Zhigang2（1.Department of the Nuclear Medicine，the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing400010，China；2.The Ultrasonic Imaging Institute of Chongqing Medical University，Chongqing400010，China）

ObjectiveTo analyze the 80SNP loci of 14genes about BRAF，RET，MEN1，F(xiàn)OXE1，ect，to study the pathogenesis and the clinical diognosis，treatment and prevention value of these genes in the TC.MethodsAccording to the criteria until December，2011，we selected 80high imformative SNPs loci of 14genes from 77PUBMEDS.We collected 11cases of TC（8cases of PTC，2cases of FTC and 1case of pDTC）and 22cases of TA.The DNA was extrated by DNA purification kit，the SNP loci sequence were analysed by Sequenom Mass ARRAY，the result were analysed with SPSS17.0.Results（1）We found the expression of 80 SNPs in the TC and TA，except rs 1733832of BRAF.（2）There were significant difference in the expression of rs669976of MEN1 and rs965513of FOXE1mutation between TC and TA（P＜0.05）.（3）The expression of rs722494from TP53detected significant difference between TC and TC paraneoplastic（P＜0.05）.（4）The incidence rate of the fusion type of 80SNPs were 47.5%，7.5%and 8.75%in PTC，F(xiàn)TC and pDTC；the incidence rate of the deletion type of 80SNPs were 2.5%and 1.25%in PTC and FTC.ConclusionWe study the important role of 80SNPs loci of TC in the pathogenesis，development and the identification of benign and malignant of TC.This conclusion provides future research direction and potential clinical diagnose and treatment value for TC relapse and metastasis，dedifferentiation diagnose，treatment，prevention intervention and the application of molecular targeted inhibitors.

thyroid neoplasms；polymorphism，single nucleotide；genotyping

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.002

A

1671－8348（2012）34－3580－03

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（81130025）；國(guó)家自然科學(xué)基金中加資助項(xiàng)目（81110219）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30900371）。 △

，Tel:023－63693339；E－mail:yuan＿gb＠126.com。

2012－06－09

2012－08－22）