某地區(qū)哈薩克族肥胖兒童ApoE基因多態(tài)性研究＊

張季紅，王曉英，徐佩茹△，常忠生

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，烏魯木齊830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院兒科，烏魯木齊830002）

某地區(qū)哈薩克族肥胖兒童ApoE基因多態(tài)性研究＊

張季紅1，王曉英2，徐佩茹1△，常忠生1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，烏魯木齊830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院兒科，烏魯木齊830002）

目的探討烏魯木齊周邊地區(qū)哈薩克族兒童肥胖與載脂蛋白E（ApoE）基因多態(tài)性的關(guān)系。方法 選擇98例超質(zhì)量／肥胖哈薩克族兒童（病例組）及88例健康者（對照組），采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片斷長度多態(tài)性分析（PCR－RFLP）方法測定ApoE基因型及等位基因頻率。結(jié)果（1）病例組與對照組的基因型頻率ε3／3、ε2／3、ε4／4、ε2／2和ε3／4基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。病例組和對照組ApoEε4等位基因頻率分別為6.12%和2.87%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（2）病例組和對照組女性ApoEε4等位基因頻率分別為7.44%和1.09%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論ApoEε4等位基因是哈薩克族肥胖的危險因素，尤在女性兒童肥胖的發(fā)病中起重要作用。

肥胖；載脂蛋白E類；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；哈薩克族兒童

近年來，兒童肥胖發(fā)病率正逐年升高，已成為全球關(guān)注的主要健康問題。在新疆地區(qū)進行的肥胖兒童調(diào)查顯示，6～16歲維吾爾族、哈薩克族、漢族和回族4個民族兒童肥胖總患病率為5.66%。而哈薩克族位居新疆不同民族學(xué)齡兒童肥胖患病率之首，為8.94%［1］。載脂蛋白（apolipoprotein，Apo）E包含3個等位基因（ε2、ε3、ε4）和6種常見的基因表型（ε2／2、ε3／3、ε4／4、ε2／3、ε2／4、ε3／4），是一種由遺傳決定的具有多態(tài)性的蛋白質(zhì)，其中Apo E4等位基因是動脈粥樣硬化的危險因素之一，據(jù)研究可能是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的重要遺傳標(biāo)記［3］。哈薩克族兒童肥胖發(fā)病率較高，但目前對哈薩克族兒童ApoE基因多態(tài)性的研究極少。為探討哈薩克族單純性肥胖兒童中ApoE基因變異與肥胖的關(guān)系，本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR－RELP）方法對新疆地區(qū)186名哈薩克族超質(zhì)量／肥胖兒童和非肥胖兒童ApoE基因型變異及等位基因頻率的差異進行了初步研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集新疆烏魯木齊市周邊城市數(shù)所哈薩克族小學(xué)校進行健康普查，進行隨機整群抽樣，并且排除其他疾病導(dǎo)致的肥胖。體質(zhì)量參照人群采用中國城區(qū)0～18歲男、女兒童身高、體質(zhì)量值為參照［4］，體質(zhì)量超過平均標(biāo)準(zhǔn)的15%為超質(zhì)量，超過20%為肥胖，超過20%～29%者為輕度肥胖，超過30%～49%為中度肥胖，重度肥胖為超過50%者。病例組（超質(zhì)量／肥胖兒童）98例，其中男51例，女47例，年齡為6～12歲；對照組為同區(qū)小學(xué)校哈薩克族非肥胖兒童，年齡性別與肥胖組基本配對，體質(zhì)量不超過標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量的10%，共88例，年齡6～12歲，其中男44例，女44例。所有研究對象均征得家長同意并簽字，同時經(jīng)過本醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。研究對象禁食12h后，抽取外周靜脈血5mL，加到含2%乙二胺四乙酸二鉀（EDTA－K2）抗凝管中，混勻，經(jīng)8 000r／min離心后，小心吸取上清液留取作生化檢測，其余－20℃凍存。

1.2 方法

1.2.1 體格測量 由專業(yè)培訓(xùn)過的人員用校正的身高、體質(zhì)量計測量，受試兒童免冠、脫鞋測量立式身高。身高精確至0.1 cm。測量體質(zhì)量清晨空腹僅穿短內(nèi)褲測量，體質(zhì)量精確至0.1 kg。計算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）＝體質(zhì)量（kg）／身高2（m2）。

1.2.2 血清的采集和制備 晨起抽取空腹靜脈血2mL，靜置后以3 000r／min離心15min，上清液制備血清。并貯于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因組DNA的制備 靜脈血2mL，經(jīng)EDTA抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞后，傳統(tǒng)酚氯仿法抽提DNA。

1.2.4 ApoE基因的PCR擴增及酶切消化 引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。引物按文獻［5］設(shè)計，上游引物序列為5′－AGA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC－3′，下 游 引 物 序 列 為 5′－TAA GCT TGG CAG GCT GTC CAA GGA－3′。PCR反應(yīng)體系為30μL，內(nèi)容如下:（1）3μL DNA模板；（2）10×PCR反應(yīng)緩沖液3μL（不含 Mg2＋）；（3）2mmol／L dNTP 0.45μL；（4）3μL 二甲基亞砜（DMSO），25mmol／L MgCl22.2μL；（5）10μmmol／L上游引物1.5μL；（6）下游引物1.5μL；（7）去離子水15.2μL，（8）Tag DNA聚合酶0.75U。PCR的反應(yīng)條件為:先行95℃預(yù)變性5min，繼而95℃變性1 min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸10min，終末降至4℃。所得PCR產(chǎn)物，加限制性內(nèi)切酶HhaⅠ于37℃水浴中過夜，充分酶切消化，采用5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，后紫外燈下攝像。

表1 健康兒童與超質(zhì)量／肥胖兒童ApoE基因型和等位基因頻率分布比較

表2 不同性別超質(zhì)量／肥胖組和對照組ApoE基因型和等位基因頻率分布比較

1.3 主要儀器與試劑 采用 Mettler Toledo LD202電子天平、Beckman L8－55型超速離心機、DYY－6C型電泳儀、日本SanYo MDF－U52V超低溫冰箱、DK－8A快速恒溫數(shù)顯水箱、DYCP－31DN型水平電泳槽、BIO－RAD Gel DOC 2000凝膠成像儀、PCR熱循環(huán)儀為BIO－RAD公司產(chǎn)品；所用試劑蛋白酶K、dNTP、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HhaⅠ均為上海生工生物工程公司產(chǎn)品。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，吻合度檢驗確定符合Hardy－Weinber平衡定律，組間比較用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05（雙側(cè)），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肥胖組與對照組ApoE基因型和等位基因頻率分布比較除ε2／4基因型未鑒別到外，ε3／3基因型頻率在超質(zhì)量／肥胖組和對照組中最高，ε3／4和ε2／3基因型頻率次之，ε4／4和ε2／2基因型最少。而在超質(zhì)量／肥胖組中，ε3／3基因型頻率為85.65%，略低于對照組的89.88%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；超質(zhì)量／肥胖組ε3／4基因型頻率為8.16%，對照組為5.62%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；超質(zhì)量／肥胖組ε3／2基因型頻率為3.06%，對照組為2.24%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 超 質(zhì) 量／肥 胖 組 ApoEε4 等 位 基 因 頻 率 為6.12%，高于對照組的2.87%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝41.27，P＜0.05），兩組 ApoEε3和 ApoEε2等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 肥胖組與對照組不同性別ApoE基因型和等位基因頻率分布比較 超質(zhì)量／肥胖組和對照組ε3／3、ε2／3和ε3／4基因型在男、女不同性別中的頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。超質(zhì)量／肥胖組女性和對照組女性ApoEε4等位基因頻率分布分別為7.44%和1.09%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝4.569，P＜0.05），而在男性兩組無明顯差異。超質(zhì)量／肥胖組和對照組ApoEε2和ApoEε3等位基因頻率在不同性別間的比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

圖1 ApoE基因突變電泳結(jié)果

3 討 論

ApoE基因是位于第19號染色體長臂13區(qū)2帶（19q13，2）上的有多態(tài)性改變的基因。其3個等位基因，ε2、ε3和ε4，可產(chǎn)生ε2／2、ε2／3、ε3／3、ε4／4、ε2／4、ε3／4共6種基因型，即有對應(yīng)的ApoE 2／2、ApoE 2／3、ApoE 3／3、ApoE 4／4、ApoE 2／4、ApoE 3／4 6種遺傳表現(xiàn)型［5］。

本研究顯示，烏魯木齊周邊地區(qū)哈薩克族兒童中存在ApoE基因型及等位基因頻率的差異，其中ε3／3基因型發(fā)生頻率最高，ε2／2基因型發(fā)生頻率最低，而ε2／4基因型未檢出。本實驗發(fā)現(xiàn)，ApoE等位基因最常見為ε3、ε2等位基因發(fā)生頻率最低，與國內(nèi)外報道相一致。ApoEε4等位基因在肥胖組要明顯高于對照組，在哈薩克族女性兒童中尤為顯著，說明ApoE ε4等位基因是哈薩克族兒童肥胖的危險因素之一，尤其對哈薩克族女性肥胖兒童的發(fā)病起重要作用。

ApoE基因在調(diào)節(jié)血脂與脂蛋白代謝方面具有重要作用，故被認(rèn)為是肥胖的重要候選基因之一［6］。近年研究表明，ApoE基因結(jié)構(gòu)功能異常與高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病的有著密切的相關(guān)性。ε4等位基因是冠心?。╟hronic heart failure，CHD）的重要遺傳標(biāo)記，而ε2等位基因則對人體起保護作用［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克族超質(zhì)量／肥胖兒童與非肥胖兒童比較，其ε4等位基因頻率增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示哈薩克族肥胖兒童已存在促進CHD發(fā)生的危險因素，攜帶ε4等位基因的哈薩克族肥胖兒童成年后有患CHD的危險性。受檢的哈薩克族兒童體質(zhì)指數(shù)與成年后患CHD是否有相關(guān)性，以及與ApoE基因多態(tài)性的關(guān)系還有待進一步研究。

有研究表明，ApoE基因多態(tài)性與血脂的代謝水平相關(guān)［8］。ε4等位基因作為CHD的遺傳易患因子，可能引起高膽固醇血癥，在單純性肥胖兒童中ε4明顯增高。本研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克族超質(zhì)量／肥胖兒童ApoE基因ε4等位基因頻率高于非肥胖兒童，哈薩克族肥胖兒童發(fā)生機制可能與脂代謝紊亂有關(guān)，ApoE基因多態(tài)性可能通過影響血脂水平，從而增加哈薩克族成年人患CHD的風(fēng)險。已有研究表明，單純性肥胖兒童較非肥胖兒童發(fā)生CHD的年齡更早，因此，從基因角度分析，哈薩克族兒童肥胖發(fā)病率高于其他民族的因素，盡管是多因素的，與飲食和環(huán)境有關(guān)，但還具有遺傳易感性，哈薩克族肥胖兒童成年后患心血管疾病的風(fēng)險高于其他民族。因此，為了預(yù)防哈薩克族CHD的發(fā)生，應(yīng)從兒童開始注重對危險因素的評估。通過及早進行基因型檢測，早期發(fā)現(xiàn)高危人群，以便及時進行干預(yù)治療，這對哈薩克族整體人群健康具有重要的臨床意義。

［1］徐佩茹，張衛(wèi)平，阿依古麗，等.新疆地區(qū)不同民族學(xué)齡兒童肥胖患病率及相關(guān)因素分析［J］.中華現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，3（1／2）:107－109.

［2］Davignon J，Gregg RE，Sing CF.Apolipoprotein E polymorphism and athosclerosis［J］.Arteriosclerosis，1988，8（1）:1－21.

［3］Peter WF，Richard H，Martin G，et al.Apolipoprotein E alleles，dyslipdemia and coronary heart disease［J］.JAMA，1994，272:1666－1671.

［4］吳瑞萍，胡亞美，江載芳.諸福棠實用兒科學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1997:567－569.

［5］王蓮，劉長云，趙園園，等.單純性肥胖兒童脂代謝與LEPR及ApoE基因多態(tài)性的相關(guān)性研究［J］.中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志，2007，3（4）:189－193.

［6］蔡建光，印大中.阿爾茨海默病主要相關(guān)基因及其功能蛋白研究進展［J］.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2006，13（2）:120－124.

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The study of Apolipoprotein E gene polymorphism with obesity in Karzak children in an area＊

Zhang Jihong1，Wang Xiaoying2，Xu Peiru1△，Chang Zhongsheng1
（1.Department of Paediatrics，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi，Xingjiang830011，China；2.Department of Paediatrics，Xinjiang Uygur Autonomous Region People′s Hospital，Urumqi，Xingjiang830002，China）

ObjectiveTo study the relevance of Apolipoprotein E gene polymorphism and obesity in Xinjiang Karzak children.MethodsUsing polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism（PCR RFLP），to determine the apolipoprotein E genetypes and allele frequency in 98cases of patients with obesity，and 88cases of normal control.Results（1）there were not difference amongε3／3，ε2／3，ε4／4，ε2／2andε3／4genetype from children with simple obesity and normal control.The allele frequency of ApoEε4was higher in obese group than that in normal control，6.12%and 2.87%（P＜0.05）.（2）ApoEε4allele frequency in female in obese group and normal control such as 7.44%and 1.09%，this difference also had statistically significance（P＜0.05）.ConclusionApoEε4allele frequency is a risk factor of Karzak children obesity.especially in femal obese Karzak children.

obesity；apolipoproteins E；polymorphism，genetic；Karzak child

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.004

A

1671－8348（2012）34－3586－02

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目（200521116）。 △

，Tel:13009679209；E－mail:xupeiru126＠126.com。

2012－07－02

2012－09－18）

·臨床研究·