堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株免疫劑量研究

舒凡帆，董 輝，趙其平，李 婷，朱順海，韓紅玉，姜連連，孔春林，王 曄，薛 璞，鄒豐才，黃 兵＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明650201；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬（Eimeria）球蟲(chóng)引起的一種原蟲(chóng)病，能引起雞生長(zhǎng)發(fā)育停滯，飼料報(bào)酬降低，甚至死亡，對(duì)全球養(yǎng)雞業(yè)每年造成大約20億英鎊損失［1］。長(zhǎng)期以來(lái)，抗球蟲(chóng)藥是預(yù)防和控制球蟲(chóng)病的主要方法，但藥物無(wú)節(jié)制的使用導(dǎo)致球蟲(chóng)抗藥性的大量產(chǎn)生。另一方面，政府和消費(fèi)者希望藥物添加劑能逐步被淘汰。幸運(yùn)的是，用球蟲(chóng)活疫苗來(lái)代替藥物已經(jīng)被證明是可行的方法，目前歐盟約80%的雞群是通過(guò)使用商品化球蟲(chóng)活疫苗來(lái)免疫預(yù)防球蟲(chóng)?。?］。

堆型艾美耳球蟲(chóng)（E.acervulina）對(duì)雞致病力中等，主要寄生于雞十二指腸，分布廣、感染率高，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害僅次于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)［3］。在中國(guó)，堆型艾美耳球蟲(chóng)是肉雞養(yǎng)殖中最常見(jiàn)的3種球蟲(chóng)之一，也是球蟲(chóng)活疫苗常包含的蟲(chóng)種之一［4］。

通過(guò)前期研究，已獲得一株堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株。該早熟株致病力比母株弱，免疫原性與母株相當(dāng)，遺傳穩(wěn)定性好，對(duì)7種常見(jiàn)抗球蟲(chóng)藥物敏感［5－6］。本文擬研究該早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效果，為確定推薦免疫劑量和制備球蟲(chóng)活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 二黃雞，購(gòu)自上海市郊某孵化場(chǎng)。飼養(yǎng)于嚴(yán)格控制的無(wú)球蟲(chóng)的隔離籠舍中，飼喂不添加任何抗球蟲(chóng)藥的全價(jià)飼料。試驗(yàn)前連續(xù)2 d檢查糞便，確認(rèn)無(wú)球蟲(chóng)感染。

1.1.2 蟲(chóng)株 堆型艾美耳球蟲(chóng)母株（資源號(hào)CAAS 2111101），由黃兵等用單卵囊分離技術(shù)分離于上海郊區(qū)某大型雞廠(chǎng)，潛在期99 h。堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株（資源號(hào)CAAS 2111105），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所誘導(dǎo)獲得，潛在期84 h［5］。2個(gè)蟲(chóng)株孢子化卵囊置于25 g／L的重鉻酸鉀溶液中4℃保存，試驗(yàn)前經(jīng)雞體傳代獲得新鮮卵囊后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 第一批試驗(yàn) 將480只6日齡雛雞逐只稱(chēng)重，按每組30只雞隨機(jī)分為16組，調(diào)整各組體重基本相同。7日齡進(jìn)行首免，其中第1組～第7組用早熟株免疫，免疫劑量分別為每只雞100、200、400、600、800、1 000及2 000個(gè)孢子化卵囊；第8組～第14組用母株免疫，免疫劑量與早熟株相同。第15組為陽(yáng)性對(duì)照組（不免疫攻蟲(chóng)組），第16組為空白對(duì)照組（不免疫不攻蟲(chóng)組）。14日齡進(jìn)行二免，各組免疫劑量與首免相同。二免后7 d稱(chēng)重，計(jì)算6日齡～21日齡期間（免疫期間）各組的增重。除第16組外，各組分別用母株進(jìn)行攻蟲(chóng)，劑量為每只雞15×104個(gè)孢子化卵囊。攻蟲(chóng)后4 d～7 d，每天收集糞便稱(chēng)重，用麥?zhǔn)舷x(chóng)卵計(jì)數(shù)法計(jì)每克糞便卵囊數(shù)（OPG），統(tǒng)計(jì)各組平均每只雞的卵囊排出總量，計(jì)算卵囊減少率。28日齡結(jié)束試驗(yàn)，逐只稱(chēng)重、處死，取十二指腸進(jìn)行腸道病變記分，并計(jì)算21日齡～28日齡期間（攻蟲(chóng)期間）的增重。試驗(yàn)期間觀(guān)察記錄各組雞的精神、食欲、飲水、發(fā)病、死亡及糞便狀況。

1.2.2 第二批試驗(yàn) 根據(jù)第一批試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)獲得的兩個(gè)免疫效果較好的劑量進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。取120只雞稱(chēng)重，按每組30只雞隨機(jī)分為4組，調(diào)整各組體重基本相同。第1組和第2組為第一批試驗(yàn)免疫效果較好的兩個(gè)免疫組，第3組為不免疫攻蟲(chóng)組，第4組為不免疫不攻蟲(chóng)組。7日齡首免，14日齡二免，21日齡稱(chēng)重后，除了第4組外，其余各組每只雞接種母株20×104個(gè)孢子化卵囊。攻蟲(chóng)后處理措施、試驗(yàn)周期等與第一批試驗(yàn)相同。

1.2.3 觀(guān)測(cè)指標(biāo) 用3項(xiàng)指標(biāo)綜合判斷：①病變記分，依據(jù)腸道病變程度分別記為0～4分。②相對(duì)增重率，以攻蟲(chóng)后7 d間各組的增重占不免疫不攻蟲(chóng)組增重的百分率，即相對(duì)增重率＝（各組平均增重÷不免疫不攻蟲(chóng)組平均增重）×100。③卵囊減少率，以各組平均每只雞在攻蟲(chóng)后4 d～7 d排出卵囊量計(jì)算卵囊減少率，卵囊減少率＝（不免疫攻蟲(chóng)組排出卵囊總量－免疫攻蟲(chóng)組排出卵囊總量）÷不免疫攻蟲(chóng)組排出卵囊總量×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組的相對(duì)增重及病變記分進(jìn)行方差分析，其中，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 第一批試驗(yàn)

堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，在增重方面，各免疫組在免疫期間的增重和不免疫組相當(dāng)（P＞0.05）；攻蟲(chóng)期間免疫劑量為400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽的增重均與健康對(duì)照組相當(dāng)（P＞0.05），其中600、800個(gè)／羽的增重更接近健康對(duì)照，而免疫劑量為100個(gè)／羽～200個(gè)／羽的增重明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.05）。在腸道病變記分方面，各免疫組病變記分相當(dāng)，均輕于感染對(duì)照組，但差異不顯著。在卵囊減少率方面，免疫劑量400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽的卵囊減少率超過(guò)90%，而免疫劑量100個(gè)／羽和200個(gè)／羽的卵囊減少率相對(duì)偏低。綜合免疫劑量、免疫期間與攻蟲(chóng)期間的增重、卵囊減少率等指標(biāo)分析，擬將600、800個(gè)卵囊／羽作為堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株的推薦免疫劑量，進(jìn)行第二批試驗(yàn)。

表1 堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效力Table1 The effectiveness of different immunizing dosages with precocious line of E.acervulina

堆型艾美耳球蟲(chóng)母株試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在增重方面，各免疫組在免疫期間的增重和健康組相當(dāng)（P＞0.05）；攻蟲(chóng)后，免疫劑量為600個(gè)／羽～1 000個(gè)／羽的增重與健康對(duì)照組相當(dāng)（P＞0.05），均明顯高于不免疫感染對(duì)照組（P＜0.05），而免疫劑量為100個(gè)／羽～400個(gè)／羽和2 000個(gè)／羽的增重均與不免疫感染組相當(dāng)。在腸道病變記分方面，各免疫組病變記分相當(dāng)，均輕于感染對(duì)照組，但差異不顯著。在卵囊減少率方面，免疫劑量400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽卵囊減少率高達(dá)90%以上，免疫劑量100個(gè)／羽和200個(gè)／羽在卵囊減少數(shù)量方面較差。

表2 堆型艾美耳球蟲(chóng)母株不同免疫劑量的保護(hù)效力Table2 The effectiveness of different immunizing dosages with parent strain of E.acervulina

2.2 第二批試驗(yàn)

堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株免疫劑量600、800個(gè)／羽的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，各免疫組在免疫期間的增重與不免組相當(dāng)；攻蟲(chóng)后，兩個(gè)免疫組的增重與健康對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），均明顯高于不免疫攻蟲(chóng)組（P＜0.05）。在腸道病變記分方面，兩個(gè)免疫組均未出現(xiàn)病變，明顯低于感染對(duì)照組。在卵囊產(chǎn)量方面，兩個(gè)免疫組的卵囊減少率均在88%以上。結(jié)果再次表明，用堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株600個(gè)／羽和800個(gè)／羽免疫后均可獲得良好的免疫保護(hù)效果。

表3 堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株不同免疫劑量重復(fù)試驗(yàn)保護(hù)效力Table3 The effectiveness of different immunizing dosages with precocious line of E.acervulina（Repeated）.

3 討論

球蟲(chóng)感染宿主后可在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。自然感染中，雞球蟲(chóng)的免疫原性主要在裂殖生殖階段，尤其是第2代裂殖生殖階段，而有性生殖階段幾乎沒(méi)有免疫原性。對(duì)于堆型艾美耳球蟲(chóng)，主要是在第2代裂殖生殖階段誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生大量免疫力［7］。與母株相比，堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株的生活史中缺少第3、4代裂殖子［8］。因此，堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株在不影響其免疫原性的基礎(chǔ)上通過(guò)減少配子體和卵囊形成數(shù)量而降低致病性。本試驗(yàn)以母株作為對(duì)照，對(duì)堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株的免疫原性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，該早熟株的免疫原性與同等劑量的母株相當(dāng)，表明其保持了良好的免疫原性，這與已有的研究一致［7］。

雞感染球蟲(chóng)后，對(duì)同種球蟲(chóng)再感染獲得部分保護(hù)力。但球蟲(chóng)誘發(fā)宿主免疫力強(qiáng)弱、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短隨種類(lèi)的不用而異，基本取決于各自的生物學(xué)特點(diǎn)。研究表明，堆型艾美耳球蟲(chóng)的免疫原性介于巨型艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)之間，可使雞產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)力。但堆型艾美耳球蟲(chóng)不同株之間存在遺傳變異，說(shuō)明其不同株之間的免疫原性存在著明顯差異。為了研制球蟲(chóng)活疫苗，需要對(duì)疫苗蟲(chóng)株的推薦免疫劑量進(jìn)行研究。已有研究表明雞獲得的保護(hù)性免疫效果與球蟲(chóng)的免疫劑量存在相關(guān)性。免疫劑量越大，其抗攻擊能力越強(qiáng)，但免疫劑量過(guò)大，則導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞大量損傷而難以在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)，影響飼料的轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟(jì)效益；免疫劑量過(guò)小，使基礎(chǔ)免疫量減少，不能有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫力抵抗大劑量的攻蟲(chóng)，容易造成疫苗反應(yīng)加劇或球蟲(chóng)病暴發(fā)［8］。因此，需要在不同免疫劑量之間找到推薦免疫劑量。但由于至今尚無(wú)判定球蟲(chóng)推薦免疫劑量的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同研究者采用的判定指標(biāo)不同。華紹桂等［9－10］以成活率、費(fèi)用、料重比、均重、飼料指數(shù)等5項(xiàng)指標(biāo)，Long P L等以增重和病變記分等2項(xiàng)指標(biāo)，本試驗(yàn)選用增重、病變記分和卵囊減少率等3項(xiàng)指標(biāo)作為判定指標(biāo)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，用堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株和母株免疫雛雞后都能產(chǎn)生一定的保護(hù)能力，攻蟲(chóng)后二者的指標(biāo)規(guī)律性一致。比較二者增重，發(fā)現(xiàn)100個(gè)／羽～200個(gè)／羽小劑量免疫時(shí)，增重明顯低于健康對(duì)照（P＜0.05）；用400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽免疫時(shí)，除了母株2000個(gè)／羽的增重明顯低于健康對(duì)照組之外，其余各組均與健康對(duì)照組相當(dāng)（P＞0.05）。這可能是100個(gè)／羽和200個(gè)／羽免疫劑量過(guò)小，不能使雞產(chǎn)生足夠的基礎(chǔ)免疫力；免疫母株2 000個(gè)／羽對(duì)免疫雞具有較強(qiáng)的致病作用，其生長(zhǎng)受到影響，由于早熟株的致病性弱于母株，其對(duì)免疫雞只的增重影響較小。在攻蟲(chóng)后，400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽各免疫組的卵囊減少率都超過(guò)90%，各組病變記分均輕于感染對(duì)照組，表明雞只免疫后能獲得較高的免疫保護(hù)力。在400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽免疫組中，綜合增重、病變記分和卵囊減少率三個(gè)判定指標(biāo)，600個(gè)／羽和800個(gè)／羽的免疫組效果最好。低于或者高于該免疫劑量都使增重和卵囊減少率呈下降趨勢(shì)。綜合考慮到一個(gè)好的疫苗應(yīng)該是低劑量免疫、重復(fù)感染、保護(hù)效果好、副作用少、成本低等因素，建議將600個(gè)／羽作為堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株的推薦免疫劑量，該劑量也與已有研究基本一致。McDougald L R等［11］研制的堆型艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)三價(jià)疫苗中，堆型艾美耳球蟲(chóng)的免疫劑量為500個(gè)／羽。國(guó)外商品化球蟲(chóng)疫苗Paracox?中，堆型艾美耳球蟲(chóng)的免疫劑量為500個(gè)／羽～650個(gè)／羽。

本文研究了實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效果，初步擬定了制作疫苗的推薦免疫劑量，為研制球蟲(chóng)疫苗提供參考。但該劑量是在實(shí)驗(yàn)室條件下用單個(gè)蟲(chóng)株對(duì)籠養(yǎng)雞只進(jìn)行免疫獲得的，該蟲(chóng)株與其他蟲(chóng)種復(fù)配后制成疫苗的免疫保護(hù)效果還有待進(jìn)一步研究。

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