豬源鼠傷寒沙門菌的分離鑒定與耐藥性分析

張文波，李宏睿，冷 闖，鄧舜洲＊

（1.江西農業(yè)大學動物科學技術學院，江西南昌330045；2.江西農業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌330045）

沙門菌是腸桿菌科中一類分布廣泛、血清型眾多的革蘭陰性桿菌。其中有少數(shù)為致病菌，可引起多種動物的胃腸炎（即食物中毒）、傷寒、敗血癥及腸道外局灶性感染，又以胃腸炎型最為常見。豬是其重要的儲存宿主。

仔豬副傷寒（Swine paratyphoid）是由豬霍亂沙門菌、豬傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌等沙門菌屬細菌引起的一種嚴重危害仔豬生產的傳染?。?］。主要引起豬的敗血癥、腸炎、肺炎和肝炎，也可使懷孕母豬發(fā)生流產。隨著養(yǎng)豬業(yè)的集約化和規(guī)?；l(fā)展，該病對豬場正常生產的不利影響越來越大。近年，由于豬場抗生素的濫用和不當使用，沙門菌的耐藥性日趨嚴重，多重耐藥現(xiàn)象已成為該菌的主要特征之一［2］，對其防控的難度不斷加大。因而從臨床病例中分離鑒定沙門菌，進行藥敏試驗篩選敏感藥物，對防控該病有著重要的實踐意義。

2011年10月份開始，江西南昌2個規(guī)?；i場的40日齡左右仔豬出現(xiàn)消瘦、腹瀉、食欲不振等臨床癥狀，采取注射豬瘟疫苗、慶大霉素等治療措施無效。本試驗采用常規(guī)方法從該場病死仔豬的組織臟器中分離病原菌，并進行生化鑒定、動物試驗和藥敏試驗，為防控該病提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 江西南昌2個規(guī)?；i場送檢的病死仔豬。

1.1.2 微量生化鑒定管和藥敏試紙 均為杭州天和微生物試劑有限公司產品。

1.1.3 實驗動物 6周齡昆明鼠，購自南昌大學實驗動物部。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 解剖病死仔豬，無菌采集肝臟和腸道，進行細菌分離。

1.2.2 細菌分離 無菌條件下分別將病料劃線接種于兔血瓊脂培養(yǎng)基，37℃燭缸培養(yǎng)12 h～24 h，觀察細菌生長及菌落特征。

1.2.3 細菌的純培養(yǎng) 無菌挑取兔血瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)基上的單個菌落，革蘭染色并劃線接種于新的兔血瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，革蘭染色，鏡檢；將純培養(yǎng)的菌落分別劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，觀察細菌生長及菌落。

1.2.4 生化鑒定 從純培養(yǎng)物中挑取單菌落接種于普通肉湯中，220 r／min振蕩培養(yǎng)12 h，革蘭染色，鏡檢。按文獻［3］方法進行生化鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 用滅菌棉簽將培養(yǎng)菌均勻涂在普通瓊脂培養(yǎng)基上，將藥敏試紙均勻貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.6 動物試驗 參照文獻［4］方法進行。取分離菌的肉湯培養(yǎng)物（濃度為1.5×108cfu／mL），分別以0.25 mL和0.5 mL的量通過腹腔注射接種小鼠，觀察其發(fā)病的死亡情況，同時腹腔注射普通肉湯培養(yǎng)液作對照。并對死亡鼠進行剖檢和細菌分離鑒定。

2 結果

2.1 病理剖檢

送檢的病死仔豬外觀消瘦、被毛粗亂、皮膚出現(xiàn)斑疹或紫色斑點、身體末端發(fā)紺；剖檢可見盲腸、結腸腸壁增厚，結腸黏膜覆蓋糠麩樣假膜，揭開假膜可見出血點（斑）；肝腫大，表面有黃白色壞死點；心肌出血，淋巴結切面有出血點（圖1～圖5）。

圖1 仔豬消瘦 、皮膚發(fā)紅Fig.1 Piglet emaciation，skin redness

圖2 結腸腸壁增厚Fig.2 Colon wall thickening

圖3 結腸黏膜覆蓋糠麩樣物Fig.3 The bran－like material covering colonic mucosa

圖4 盲腸黏膜覆蓋糠麩樣物Fig.4 The bran－like material covering cecal mucosa

圖5 心肌出血；肝臟腫大，表面有黃灰色壞死點Fig.5 Myocaridial hemorrhage；Enlargement and surface yellow－gray necrotic points of the liver

2.2 細菌分離培養(yǎng)特性

在血瓊脂培養(yǎng)基生長良好，呈現(xiàn)圓形、半透明、灰白色、微隆起、濕潤、邊緣整齊、針尖大的露滴樣菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上，菌落均為圓形、光滑、邊緣整齊、無色半透明；在伊紅美藍培養(yǎng)基上，菌落為無色的小菌落。取純培養(yǎng)進行革蘭染色，鏡檢，可見無莢膜、無芽胞、散在的革蘭陰性短桿菌。與沙門菌的特征基本一致。

2.3 分離菌株生化鑒定結果

分離的6株菌均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和阿拉伯糖產酸產氣，賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、MR和硫化氫反應陽性，乳糖、蔗糖、VP和硝酸鹽反應陰性，運動力檢查陽性，與鼠傷寒沙門菌的生化特性一致。

2.4 藥敏試驗結果

分離菌對阿米卡星、卡那霉素、頭孢噻肟極敏感，對環(huán)丙沙星、諾氟沙星高敏，對大觀霉素、恩諾沙星、利福平、四環(huán)素、頭孢氨芐為低敏，對阿莫西林、青霉素G、復方新諾明、林可霉素為耐藥（表1）。

2.5 動物致病性試驗結果

注射0.5 mL菌液的小鼠均在15 h內死亡，注射0.25 mL菌液的小鼠均在48 h內死亡。剖檢肺臟充血，肝臟腫大、出血，腹腔中有腹水，脾臟腫大，腸黏膜出血，腸系膜水腫。從死亡鼠的肝、心、肺中分離到與接種細菌生物學特性一致的細菌。對照組小鼠無任何異常表現(xiàn)，7 d后處死剖檢，內臟無病變。表明分離菌有較強的致病性。

3 討論

沙門菌在自然界中的分布十分廣泛，也是一種重要的條件致病菌［5］，對畜禽健康養(yǎng)殖、人類公共安全、食品安全都具有著重要的影響。尤其是近年來我國養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，沙門菌的危害越來越嚴重。

根據(jù)送檢豬場的流行病學、臨床癥狀和病死豬的剖檢變化等，初步懷疑是仔豬副傷寒。無菌采集病料進行細菌分離鑒定，結果分離的6株菌在普通瓊脂培養(yǎng)、血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基上的生長和菌落特征均與鼠傷寒沙門菌的一致。

表1 分離菌的藥敏試驗結果Table1 The results of drug sensitivity test of isolate strains mm

沙門菌常存在豬體內尤其是腸道內，且腸道內存在多種類似菌群，因此從腸道和糞便中分離到沙門菌并不能證實是致病菌。只有證明分離的沙門菌有強致病性，才能確診是沙門菌?。?］。本次試驗中，選擇大小2種劑量的分離菌肉湯培養(yǎng)物，接種小鼠。結果2倍劑量組的小鼠在接種后15 h內全部死亡，單倍劑量組的小鼠在接種后48 h內全部死亡，且可從死亡鼠中分離到與原分離菌生物學特性一致的細菌，表明分離的鼠沙門菌有強致病性，是引起豬場發(fā)病的病原菌。

張瑋等［8］采用直腸棉拭子從健康豬腸道內分離到22株沙門菌，藥敏試驗結果表明，分離菌的耐藥性非常強，僅對部分第3代頭孢類敏感，其中耐4種以上抗生素的多重耐藥菌株達90.9%。張琦等［9］對分離的豬源鼠傷寒沙門菌進行藥敏試驗結果表明，分離菌僅對先鋒噻肟、菌必治、呋喃妥因、頭孢呋肟等藥物有效，而對其他臨床常用的12種抗菌藥物均耐藥。Varga C等［10］檢測并比較了加拿大阿爾伯塔省922株豬源大腸埃希菌和922株豬源沙門菌對15種抗菌藥物的耐藥性，結果沒有l(wèi)種菌耐第3代頭孢菌素和喹諾酮類藥物，70.2%的大腸埃希菌和28%的沙門菌耐2至多種抗菌藥物。其他的研究報道與國內的大致相同［11－12］。這些研究結果說明，目前規(guī)?；i場沙門菌的耐藥性正在不斷發(fā)生變化，且耐藥性逐漸增強。雖然抗生素在沙門菌的防控中發(fā)揮著重要的作用，但隨著養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用和不規(guī)范使用，細菌在藥物的選擇性壓力下，不斷發(fā)生變異，以適應藥物環(huán)境，其中以多重耐藥和耐藥譜不斷擴大最為常見［13］，且已成為目前沙門菌的主要特征之一。因此，分離鑒定沙門菌，了解其耐藥性及篩選藥物仍是防控沙門菌的重要方式。

本次分離菌的藥敏試驗結果表明，分離菌株的耐藥性較強，且呈多重耐藥性。結果與文獻［14－15］報道的基本一致。但2個場的藥敏試驗結果不太一致，經(jīng)詢問養(yǎng)殖人員得知，2豬場相鄰，且關系密切，平時的預防用藥和疫苗免疫程序幾乎相同，但2個場的發(fā)病早，用藥較多，導致對一些藥物的敏感度降低。根據(jù)藥敏試驗結果，選擇卡那霉素肌注3 d，水中添加頭孢噻肟鈉和多維，連用7 d，同時加強消毒、飼養(yǎng)管理、減少應激等綜合措施，除前4 d有豬死亡外，以后逐漸平穩(wěn)，然后再用乳酸諾氟沙星可溶性粉飲水5 d，豬群恢復正常。

隨著抗生素的大量使用，沙門菌的耐藥性不斷增強；且沙門菌的血清型多達2 500多種［16］，使用疫苗防控的難度較大；近年，隨著規(guī)模化、集約化的發(fā)展，以及疾病的演變，大部分豬群處于亞健康狀態(tài)，在應激、免疫抑制等不利因素作用下，很容易發(fā)生沙門菌的繼發(fā)、并發(fā)感染。因此，豬場在防控沙門菌病時，應在加強飼養(yǎng)管理、定期消毒、通過藥敏試驗篩選敏感藥物或其組合進行藥物預防等綜合措施，才能取得較好的效果。

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