貴州省羊口瘡的調(diào)查研究

鮮思美，胡廷帥，熊朝麗，向智龍，陳秀華

（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025；2.貴州省動物疫病研究所，貴州貴陽550025）

羊口瘡（Orf）亦稱羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎、羊傳染性膿皰，由痘病毒科（Poxviri－dae）、副痘病毒屬（Parapoxvirus）的羊口瘡病毒（Orf virus，Orfv）引起，是危害山羊和綿羊的一種高度接觸性傳染病，本病也可感染人。臨床上以患羊口唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚、黏膜形成丘疹、膿皰、潰瘍以及結(jié)成疣狀厚痂為主要特征。該病傳播迅速，流行廣泛，發(fā)病率高，對所有品種、不同性別和不同年齡羊只均可感染，其中以3月～6月齡羔羊更易感，病死率較高［1］。羊口瘡在養(yǎng)羊的國家和地區(qū)普遍發(fā)生，常呈群發(fā)性流行，是嚴重威脅養(yǎng)羊業(yè)，具有重要經(jīng)濟意義的病毒病［2］。筆者對貴州省的5個養(yǎng)羊大縣（晴隆縣、關(guān)嶺縣、赫章縣、開陽縣和大方縣的養(yǎng)羊場（戶或合作社）的羊只進行了羊口瘡的流行病學調(diào)查與實驗室診斷，現(xiàn)報告如下。

1 發(fā)病情況調(diào)查

通過流行病學調(diào)查，在貴州的5個養(yǎng)羊大縣都有羊口瘡的流行，發(fā)病率為2.2%～17.7%，病死率為0～51.4%；任何年齡的黑馬羊、沿河黑山羊、麻江黃羊和外地引進的波爾山羊均可感染羊口瘡，無性別和品種差異。以3月～6月齡羔羊發(fā)病最多，成年羊同樣易感，多發(fā)生在購入病羊或帶毒羊15 d以后。本病一年四季均可發(fā)生，但最常發(fā)生于初春或者春末夏初，氣候炎熱，干旱及枯草季節(jié)。病羊和帶毒羊為主要傳染源。自然感染主要因購入病羊或帶毒羊傳入健康羊群或者是通過將健羊置于曾有病羊用過的廄舍或污染的牧場而引起。

2 臨床癥狀觀察

根據(jù)發(fā)病時間，可分為四階段：首先在口角、唇部、鼻鏡乃至耳廓上長出散在小的突起；小的突起慢慢長大、增多，蔓延到整個口的周圍及顏面；這些突起變紅，形成水泡和膿皰，繼而連成一片；結(jié)痂、龜裂，結(jié)痂下面有肉芽組織增生，有的嘴唇外翻，形成桑葚狀痂垢（圖1）。嚴重者水皰從舌的前端向后蔓延，直到喉嚨（圖2），羔羊無法采食，精神高度沉郁，乃至危及生命。根據(jù)發(fā)病的部位可分為唇形、乳房型（圖3）、外陰型（圖4）和混合型。其中以唇形較為常見。

圖1 口唇、鼻孔周圍的皮膚出現(xiàn)丘疹Fig.1 Lips and nostrils surrounding skin papules

圖2 膿皰延伸至舌根部Fig.2 Pustular extending to the base of the tongue

圖3 乳房型Fig.3 Breast type

圖4 外陰型Fig.4 Type of vulva

3 病理變化

3.1 大體剖檢病變

病死山羊尸體十分消瘦。其唇周痂皮下有肉芽組織增生，呈鮮紅色，整個嘴唇外翻呈桑葚狀突起，口腔內(nèi)有水皰、潰瘍和糜爛，膿皰破潰后，成黃色或棕色的疣狀結(jié)痂，舌根、喉頭、咽部等部位紅腫，頜下淋巴結(jié)腫大。胃腸幾乎無內(nèi)容物，其他內(nèi)臟器官未發(fā)現(xiàn)明顯病變。

3.2 皮膚病變

選取有病變的口唇部位，用100 mL／L的福爾馬林固定組織24 h后，流水沖洗一夜，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、制備5μm切片，進行蘇木素－伊紅（HE）染色，通過顯微鏡觀察，可見細胞發(fā)生“氣球樣變”（圖5）?！皻馇驑幼儭钡募毎屏?，與細胞間膿性水腫液融合成水皰或膿皰。并可見到出血現(xiàn)象（圖6）。

圖5 細胞"氣球樣變"（HE 400×）Fig.5 Cell Ballooning（HE 400×）

圖6 出血現(xiàn)象（HE 400×）Fig.6 Bleeding phenomenon（HE 400×）

4 病原檢查

4.1 電鏡觀察

采取疫區(qū)的疑似病料研磨成病料懸液，5 000 r／min離心30 min，上清液用0.45μm濾膜過濾，濾液采用30 g／L戊二醛固定后滴于銅網(wǎng)上5 min，再滴加10 g／L磷鎢酸染液負染2 min，將多余的染液吸干，在電鏡下觀察?？梢姴×蠎乙褐杏型暾?、堆積的Orf V，也有單在、破碎的病毒粒子，呈卵圓形線團樣，表面呈繩索樣纏繞結(jié)構(gòu)，大小為150 nm～200 nm×230 nm～260 nm，粒子外有被膜包裹（圖7，圖8）。

4.3 PCR診斷

根據(jù)GenBank中Orf V的全基因序列，選擇較保守的 H2L基因設(shè)計1對引物。P1：5′－CGA ACT TCC ACCTCA ACC ACT CC－3′，P2：5′－CCT TGA CGATGT CGC CCT TCT－3′，預(yù)計擴增目的片段大小為507 bp，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR反應(yīng)采用50μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（含 MgCl2）5μL，d NTPS（10 mmol／L）1μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U／μL）1μL，上下游引物（10 pmo L／μL）各2.5μL，DNA 模板1μL，滅菌雙蒸水 （dd H2O）補足至50μL。

擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用10 g／L瓊脂凝膠（含8 g／L的賽百盛GOLD VIEWTM），以80 V電壓在1×TAE的緩沖液中電泳20 min。凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果（圖9）。

由圖9可見，5份待檢病料提取的DNA樣本，經(jīng)PCR擴增后，均擴增出一條約507 bp的特異性條帶，大小與陽性對照株相同，而陰性對照無擴增條帶。

5 討論

根據(jù)流行病學調(diào)查、臨床癥狀、病理剖檢變化可對該病作出初步診斷，經(jīng)病理組織切片觀察、電鏡負染和PCR對該病進行了確診。貴州省的5個養(yǎng)羊大縣（晴隆縣、關(guān)嶺縣、赫章縣、開陽縣和大方縣的養(yǎng)羊場（戶或合作社）均有羊口瘡的流行。

本病在世界許多國家和地區(qū)均有發(fā)生，南非、澳大利亞、新西蘭、希臘、土耳其、意大利、印度、美國、捷克、波蘭、俄羅斯、阿塞拜疆、吉爾吉斯斯坦等國家均有本病的流行。我國甘肅、寧夏、四川、江蘇、云南、青海、湖北、陜西、西藏、山東、福建、內(nèi)蒙、新疆、貴州和黑龍江等省區(qū)均有該病的流行報道［1］。在貴州省養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展過程中，由于品種的引進及基礎(chǔ)群的建立，從國外及省外多批次引入動物，畜禽流動比較頻繁，易引起羊口瘡的傳播和流行［3－5］。

羊口瘡病毒與山羊痘病毒均屬于痘病毒科，引起山羊、綿羊的嗜上皮性、人獸共患傳染病。羊口瘡與山羊痘在貴州省均有發(fā)生，且兩者臨床癥狀和病理變化上存在許多相似之處，從而難以及時鑒別診斷。但羊口瘡傳播迅速，病變通常局限于口唇、眼、鼻周圍具有增生性桑葚狀痂垢，病羊不顯全身癥狀，而山羊痘病毒感染病羊體溫升高，痘疹或痘皰呈全身分布［6］。病原鑒定最常用的方法是電子顯微鏡觀察和PCR方法［7－10］。羊口瘡病毒顆粒通常呈線團樣的橢圓形，它的最大特征是表面呈繩索樣纏繞結(jié)構(gòu)，而山羊痘病毒表面呈短棒樣結(jié)構(gòu)圍繞［11］。

［1］文心田，于恩庶，徐建國，等.當代世界人獸共患病學［M］.四川成都：四川科技出版社，2011：449－459.

［2］顏新敏，張 強.羊口瘡病毒的研究進展［J］.中國動物檢疫，2008，25（11）：51－53.

［3］楊 德，鄧位喜，周小波，等.一起山羊傳染性膿皰的治療［J］.貴州畜牧獸醫(yī)，2006，30（3）：40.

［4］楊義虹，韓凌會，吳 旭，等.山羊口瘡的治療［J］.貴州畜牧獸醫(yī)，2009，33（1）：41.

［5］向智龍，程振濤，卓建華，等.羊口瘡病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學，2010，38（7）：145－147.

［6］虞天德.貴州省部分地區(qū)山羊痘的診斷［J］.中國獸醫(yī)科技，2004（7）：74－76.

［7］朱 偉，熊 毅，劉 棋，等.快速鑒別診斷山羊痘病毒和羊口瘡病毒二聯(lián)PCR方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2007，29（5）：394－396.

［8］鄭 敏，金寧一，劉 棋，等.羊痘病毒和羊口瘡病毒二重PCR鑒別診斷方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學，2007，37（11）：931－934.

［9］顏新敏，張 強，吳國華，等.雙重PCR快速鑒別羊痘病毒和羊口瘡病毒［J］.中國人獸共患病學報，2008，24（10）：945－948.

［10］向智龍，程振濤，卓建華，等.山羊痘病毒和羊口瘡病毒雙重PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（1）：88－91.

［11］龐理化，程慶華，侯秀芬，等，羊口瘡病毒的電子顯微鏡觀察［J］.畜牧獸醫(yī)科技通訊，1980（4）：29－33.