嘔吐毒素單克隆抗體制備及鑒定

孫 震，馮才偉，李 勇，吳 鵬，馮 靜，韓京朋

（北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206）

嘔吐毒素（vomitoxin），又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），化學名稱為3α，7α，1，5－三羥基草鐮孢菌－9－烯－8－酮，屬單端孢霉烯族化合物［1－2］。單端孢霉烯族毒素共有150多種，是一類強有力免疫抑制劑，所引起典型癥狀是采食量降低，所以這類毒素又叫飼料拒食毒素，DON是其中最重要一種毒素［3－4］。

DON主要來自鐮刀菌屬（Fusarium），尤其是禾谷鐮刀菌（Fusarium grarninearum）和黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum），其結(jié)構(gòu)為四環(huán)倍半萜，分子式為 C15H20O6，分子質(zhì)量296.3 ku［5－6］。其結(jié)構(gòu)式如下（圖1）：

圖1 DON化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 DON chemical structure

由于DON具有很高的細胞毒性及免疫抑制性，因此，對人類及動物的健康構(gòu)成了威脅。1998年，在國際癌癥研究機構(gòu)公布的評價報告中，嘔吐毒素被列為3類致癌物［7］。國際上對嘔吐毒素的檢測方法研究進展較快。先后出現(xiàn)了薄層色譜法和高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、酶聯(lián)免疫（ELISA）的檢測方法［8］。目前國內(nèi)用于DON檢測的ELISA試劑盒很少，而實現(xiàn)商品化的更少。本研究期望通過研究制備出抗DON的高效價、高特異性單克隆抗體，并最終開發(fā)出可用于食品中DON檢測的酶聯(lián)免疫檢測產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DON為上海安普科學儀器有限公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）為Sigma公司產(chǎn)品；3，3′，5，5′－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、戊二醛、馬來酸酐、4－二甲氨基吡啶（DMAP）1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、二甲基甲酰胺（DMF）為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗為美國Jackson公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為北京勤邦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，細胞培養(yǎng)基RPMI－1640為Hyclone公司產(chǎn)品，其他有關(guān)化學試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 Uitrospec紫外－可見光分光光度計為Amersham公司產(chǎn)品，磁力攪拌器90－2為上海振榮科學儀器有限公司產(chǎn)品；低速離心機Anke TDL－40B為上海安亭科學儀器有限公司產(chǎn)品；酶標儀MK3為美國Thermo公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件為Syngene公司產(chǎn)品；JM－250電泳儀為大連捷麥科貿(mào)公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱DHP－600為天津市中環(huán)實驗電爐有限公司產(chǎn)品；電子天平、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 半抗原合成 取20 mg DON、1 mol馬來酸酐、催化量的DMAP，溶于2 mL甲苯中，于80℃攪拌反應(yīng)，8 h～20 h后，蒸干溶劑，酸化，萃取，重結(jié)晶后得到DON半抗原，其合成公式見圖2。

圖2 半抗原合成路線Fig.2 DON hapten synthetic route

1.2.2 DON抗原合成 將DON半抗原與BSA偶聯(lián)得到免疫原。具體操作如下：取60 mg BSA溶于9.5 mL 0.01 mol／L，p H5.0的 PBS溶液中，加入12.5 mg EDC，再加入1 mL DMF 溶解的10 mg DON半抗原，室溫攪拌反應(yīng)1 h，再加6 mg EDC，置于陰暗處攪拌反應(yīng)并過夜，用0.01 mol／L PBS透析3 d，每天更換透析液3次，得到DON－BSA，即為免疫原。將DON半抗原與OVA偶聯(lián)得到包被原。反應(yīng)步驟同免疫原制備，所用OVA量為45 mg。

1.2.3 偶聯(lián)抗原的鑒定

1.2.3.1 紫外分光光度計鑒定 將偶聯(lián)抗原進行20倍稀釋后，分別在波長260 nm、280 nm處測定紫外吸光度，根據(jù)公式（1）計算結(jié)合抗原蛋白質(zhì)濃度［9］。

利用紫外－可見光分光光度計對DON、載體蛋白、偶聯(lián)抗原進行掃描，在最大吸收波長λmax下測定其吸光值，根據(jù)公式（2）分別計算DON、載體蛋白、偶聯(lián)抗原的摩爾吸光系數(shù)。

式中：A是各物質(zhì)在最大波長處的吸光度，C是各物質(zhì)的濃度，L是比色杯的直徑。根據(jù)計算所得摩爾吸光系數(shù)（ε），按公式（3）計算偶聯(lián)抗原的結(jié)合比。

1.2.3.2 SDS－PAGE對偶聯(lián)抗原純度鑒定 將BSA、OVA 和偶聯(lián)產(chǎn)物DON－BSA、DON－OVA 用PBS（0.01 mol／L、p H7.4）適當稀釋后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。濃縮膠為50 g／L，分離膠為120 g／L，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為160 V，上樣量為10μL，考馬斯亮藍染色5 h～6 h后，置脫色液中脫色過夜。

1.2.4 Mc Ab制備

1.2.4.1 動物免疫 將合成的免疫原 DON－BSA與弗氏佐劑按1∶1的比例混合乳化，對6周齡～8周齡Balb／c小鼠進行免疫，頸背部皮下多點注射，免疫劑量為150μg／只，分別在14 d和28 d進行二免和三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同上，31 d后加強免疫，直接采用免疫原免疫，免疫劑量為100μg／只，最后1次免疫后7 d斷尾采血分離血清，3 000 r／min離心5 min，收集血清備用。

1.2.4.2 融合細胞備用小鼠選擇 先用方陣滴定法確定檢測抗原最佳包被質(zhì)量濃度，然后用間接ELISA測定所采集的小鼠血清抗體效價，以待測孔OD450值≥NC OD450值的2.1倍（P／N≥2.1）判為陽性，選取效價高的小鼠作為脾細胞提供鼠，具體方法同鄧舜洲的方法［10］。

1.2.4.3 細胞的融合、篩選、克隆化及腹水制備 細胞融合前3 d，對融合小鼠采用DON－BSA 50μg／只（不含弗氏佐劑）腹腔注射式超免。取小鼠脾細胞與Sp2／0細胞進行融合，用間接ELISA法進行篩選，所用的包被抗原是5μg／mL OVA－DON檢測抗原，分別加入被測孔的培養(yǎng)上清，以P／N＞2.1為判斷依據(jù)，篩選陽性孔，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔采用有限稀釋法進行亞克隆，亞克隆化3次后所有孔的克隆都為陽性，最終得到分泌DON－McAb的雜交瘤細胞株，最后選擇OD值高、細胞活力好的單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)、凍存、鑒定和建株。按常規(guī)法制備腹水。

1.2.5 間接競爭ELSIA建立標準曲線 取DONOVA 以0.01 mol／L p H7.4的PBS作1∶3 000稀釋，按照每孔100μL進行包被，37℃溫育2 h，傾去包被液，用PBST洗滌2次，每孔中加入200μL封閉液，37℃溫育2 h，傾去孔內(nèi)液體，備用。向酶標板微孔中加入質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5μg／L的系列DON標準品50μL／孔，隨即加入0.01 mol／L p H7.4的PBS以1∶3 000稀釋羊抗鼠酶標二抗50 μL／孔，再加入0.01 mol／L p H7.4 PBS以1∶36 000稀釋的 DON－McAb 50μL／孔，25℃反應(yīng)30 min，用PBST洗滌3次，拍干，加入顯色底物，25℃反應(yīng)15 min，加入2 mol／L的硫酸終止反應(yīng)，用酶標儀以450 nm／630 nm雙波長讀取OD值。

以酶聯(lián)免疫方法測定DON各濃度的標準品溶液的吸光度值（B），以吸光度值（B）除以零標準品吸光度值（B0）再乘以100%，得到百分吸光度值，以DON標準品濃度（μg／L）的對數(shù)值（log10C）為X軸（為方便數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用軟件分析時，通常將對數(shù)值用對應(yīng)的標準品濃度值進行替換），百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線。

1.2.6 Mc Ab鑒定

1.2.6.1 克隆抗體亞型鑒定 純化McAb用單克隆抗體Ig類／亞類鑒定試劑盒進行抗體免疫球蛋白亞型鑒定。

1.2.6.2 McAb的分子質(zhì)量測定 腹水純化后，進行SDS－PAGE。對電泳結(jié)果進行凝膠成像分析，根據(jù)抗體重鏈和輕鏈在凝膠中遷移情況以及IgG中重鏈和輕鏈的比例關(guān)系，估算出抗體分子的分子質(zhì)量。

1.2.6.3 敏感性的測定 根據(jù)間接競爭ELISA方法所繪制的標準曲線，計算DON－Mc Ab對DON的IC50值。

1.2.6.4 交叉反應(yīng)率測定 選取2種其他霉菌毒素測定交叉反應(yīng)率，通過各毒素的標準曲線分別得到其IC50。按下式分別計算Mc Ab對其它霉菌毒素的交叉反應(yīng)率：

2 結(jié)果

2.1 偶聯(lián)產(chǎn)物的分析

2.1.1 偶聯(lián)抗原濃度的測定 偶聯(lián)抗原透析后，將透析袋中的液體定量。取出少量，經(jīng)稀釋后，分別在波長260 nm、280 nm處測定紫外吸光度，計算偶聯(lián)抗原的濃度。計算結(jié)果BSA－DON的濃度為5.6 mg／mL，OVA－DON的濃度為4.1 mg／mL。

2.1.2 紫外分光光度法計算偶聯(lián)抗原的分子結(jié)合比

用紫外分光光度計分別繪制DON、BSA、BSADON和DON、OVA、OVA－DON的紫外掃描圖（圖3、圖4）。偶聯(lián)抗原特征峰發(fā)生位移，表明偶聯(lián)成功。比色杯的直徑（L）相同，根據(jù)各物質(zhì)在最大波長處的吸光度（A）和各物質(zhì)的濃度（C），按照1.2.3.1所述公式計算得出偶聯(lián)抗原的分子結(jié)合比，BSA與DON的分子結(jié)合比為1∶18.4，OVA與DON的分子結(jié)合比為1∶12.8。

圖3 DON－BSA、BSA、DON紫外掃描圖譜Fig.3 UV spectra of DON－BSA，BSA and DON

圖4 DON－OVA、OVA、DON紫外掃描圖譜Fig.4 UV spectra of DON－OVA，OVA，and DON

2.1.3 SDS－PAGE 對偶聯(lián)抗原分析 將 BSA、OVA分別與制備的偶聯(lián)產(chǎn)物BSA－DON、OVADON進行凝膠電泳分析，從電泳圖（圖5）中可以看出，因DON分子質(zhì)量很小，偶聯(lián)前后對載體蛋白分子質(zhì)量改變程度不大，所以偶聯(lián)前后蛋白質(zhì)的條帶位置變化較小。條帶的位置變化，初步證明了偶聯(lián)是成功的。

2.2 Mc Ab鑒定

2.2.1 Mc Ab工作濃度測定 采用方正滴定法確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度與抗體工作濃度，結(jié)果見表1。對于酶標儀，OD值在1～2之間時讀數(shù)的可信度較大，所以一般取OD值在1.5～2.0之間的孔所對應(yīng)的包被濃度為最佳包被濃度；另外為了后期免疫檢測產(chǎn)品的靈敏度和準確度考慮，一般控制抑制率在70%～80%之間，從表1中可知，抗原包被質(zhì)量濃度為1.0μg／mL，Mc Ab工作濃度為1∶2.4×104時OD值和抑制率均符合要求。

2.2.2 Mc Ab亞型鑒定 用Ig亞類鑒定試劑盒（Ig－Gl、Ig G2a、IgG2b、Ig M、Ig A）經(jīng)間接 ELISA 方法檢測，結(jié)果表明所得Mc Ab均為IgGl。

2.2.3 腹水抗體分子質(zhì)量測定 對所得腹水Mc Ab純化后，進行變性SDS－PAGE（圖6）。對電泳結(jié)果進行凝膠成像分析，根據(jù)抗體重鏈和輕鏈在凝膠中遷移情況以及IgG中重鏈和輕鏈的比例關(guān)系，估算出了抗體分子的分子質(zhì)量為158 ku。

表1 抗原包被濃度和抗體稀釋濃度的測定結(jié)果Table1 Result of antigen coating and antibody dilution concentration

圖6 Mc Ab電泳圖譜Fig.6 SDS－PAGE spectrum of monoclonal antibody

2.2.4 敏感性鑒定結(jié)果 根據(jù)建立的間接競爭ELSIA方法得到的DON標準曲線如圖7所示，標準抑制曲線的線性回歸方程為y＝37.267x＋61.765，標準曲線IC50為1.7μg／L，該試驗所獲Mc Ab對DON具有較高的敏感性。

2.2.5 Mc Ab特異性 交叉反應(yīng)率結(jié)果見表2。由表2可知，本試驗制備的抗DON的Mc Ab與DON的交叉反應(yīng)率很高，而與T2、黃曲霉毒素B1幾乎沒有交叉反應(yīng)，故篩選到的單抗對DON具有很強的特異性。

圖7 DON標準曲線Fig.7 Calibration curve of DON

表2 交叉反應(yīng)率檢測結(jié)果Table2 Results of cross－reactivity

3 討論

DON為小分子物質(zhì)（分子質(zhì)量296.3 u），沒有免疫原性，是不完全抗原，不能誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生抗體。必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后成為完全抗原才具有免疫原性可制備成免疫抗原［11－12］。而DON分子本身沒有可與載體蛋白結(jié)合的可供活化的功能基團，因此無法直接制備DON偶聯(lián)抗原［15］。馬來酸酐分子中有兩個羰基C＝O和兩個雙鍵C＝C共軛，因而具有活潑的化學性質(zhì)，能進行聚合反應(yīng)、異構(gòu)化、加成、自由基反應(yīng)、狄爾斯－阿爾德反應(yīng)、酯化反應(yīng)等［14］。因馬來酸酐分子中含有羧基，可與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，因而可以形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。

本研究通過化學法合成羧基化的DON，分別與BSA、OVA偶聯(lián)作為免疫抗原和檢測抗原。因為BSA與OVA之間沒有交叉抗原，所以可以用DON－BSA作為免疫抗原免疫小鼠，用DON－OVA包被酶標板，檢測DON抗體的效價。

小鼠腹水中含有大量的內(nèi)含物，為消除這些內(nèi)含物的干擾，需對腹水進行純化。腹水的純化應(yīng)根據(jù)單抗的種屬、免疫球蛋白的類型、抗體純度等選擇最佳的純化方法，同時還要考慮在純化的過程中保持抗體的活性、純度和得率等。本研究所得Mc Ab為IgG1亞型，所以可選用適用于IgGl抗體純化的辛酸－硫酸銨法對所得的腹水進行純化［15］。

本研究所得Mc Ab分子質(zhì)量為158 ku，所制備的Mc Ab對DON具有很高的敏感性（IC50＝1.7 μg／L），并且抑制標準曲線在0.5μg／L～40.5μg／L之間線性關(guān)系良好，與T2、黃曲霉毒素B1幾乎沒有交叉反應(yīng)，完全能夠滿足對于DON殘留檢測要求，篩選到的Mc Ab可用于進一步研制DON酶聯(lián)免疫檢測產(chǎn)品。

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