副豬嗜血桿菌熒光定量PCR 檢測方法的建立

苗立中，沈志強(qiáng)，韓文瑜

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春130062；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

副豬嗜血桿菌病被稱為豬革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophlius parasuis，HPS）感染引起的豬的一種傳染?。?］。近年來，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的新發(fā)典型細(xì)菌性疾?。?］，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國對副豬嗜血桿菌病的診斷主要通過傳統(tǒng)的病原分離與培養(yǎng)、血清學(xué)方法以及常規(guī)分子生物學(xué)方法。但由于HPS對營養(yǎng)要求苛刻，直接從病料中很難分離到HPS，且該菌培養(yǎng)期間易發(fā)生雜菌污染，不易純化［3］。已有多位學(xué)者建立了檢測HPS的PCR方法，但是這些常規(guī)PCR方法無法對病料中的HPS進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，而且都較繁瑣，容易出現(xiàn)假陽性，檢測結(jié)果具有波動性［4－5］。因此，有必要建立一種新的定量檢測技術(shù)。

Real－time PCR是在PCR定性技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，為實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增并進(jìn)行定量解析的方法。Real－time PCR具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性好及可靠性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又實(shí)現(xiàn)了對模板的準(zhǔn)確定量，其檢測線性范圍較寬，不易出現(xiàn)假陽性，在整個(gè)反應(yīng)過程中可自動通過分析熒光信號記錄數(shù)據(jù)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量分析，解決了PCR假陽性和溴化乙錠（EB）對環(huán)境的污染問題［6］，已成為病原學(xué)檢測的重要手段［7］。

本方法選取HPS的inf B基因中一段高度保守的基因序列作為目的片段，由此設(shè)計(jì)一對特異性引物，建立HPS基于SYBR Green I熒光染料的熒光定量PCR快速診斷和定量分析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HPS菌株，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存；大腸埃希菌DH5α、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬沙門菌、豬大腸埃希菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑及試劑盒 p MD18－T 載體、Emerald Amp PCR Master Mix（2×Premix）、SYBR Green Real Time PCR Master Mix（2×）、DNA Marker DL 2 000、EASY Dilution（For Real－time PCR）等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；多功能DNA純化回收試劑盒（離心柱型）、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒（離心柱型）和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）均為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 紫外可見分光光度計(jì)（2000／2000C型）為北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；Real－time PCR儀（light Cycler480 II型）為德國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；直流電泳儀（DYY－8C型）為北京市六一儀器廠生產(chǎn)；BIO－RAD PCR儀為BIO－RAD公司產(chǎn)品；紫外透射反射儀（WD－9403C型）為北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank數(shù)據(jù)庫中 HPS的infB基因的序列（DQ：781933.1），設(shè)計(jì)一對特異性引物，目的片段長度為129 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

inf B－F： 5′－AGTAGCAGCTGACGATGGCGTAAT－3′； infB－R： 5′－T CTACACGCTCTGGGTTTGCTTCT－3′。

1.2.2 常規(guī)PCR擴(kuò)增 采用直接水煮沸法從HPS培養(yǎng)液中提取基因組DNA［8］，作為常規(guī)PCR反應(yīng)的模板。常規(guī)PCR反應(yīng)體系為25μL，其中PCR Master Mix（2×Premix）12.5μL，去離子水10.5 μL，模板DNA 1μL，引物infB－F、infB－R各0.5μL。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取7μL PCR產(chǎn)物于10 g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

1.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

1.2.3.1 目的基因的純化回收 將1.2.2中常規(guī)PCR產(chǎn)物于10 g／L瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下切回目的片段，用多功能DNA純化回收試劑盒回收目的DNA，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 目的基因的克隆及鑒定 將回收的HPS的infB基因克隆到p MD18－T載體上，然后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定，然后用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及瓊脂糖凝膠鑒定，最后將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

1.2.3.3 重組質(zhì)粒濃度的測定 利用紫外可見分光光度計(jì)測定陽性重組質(zhì)粒的濃度，并計(jì)算其拷貝數(shù)。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 用EASY Dilution（for real time PCR）將陽性重組質(zhì)粒稀釋至1.0×1010copies／μL左右，再依次做10倍梯度稀釋，分別以109、108、107、106、105、104、103、102、101、100十個(gè)拷貝數(shù)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)模板。

1.2.4 熒光定量PCR檢測方法的建立

1.2.4.1 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法反應(yīng)條件的優(yōu)化 以標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒為模板，infB－F／R為引物，選用不同的引物濃度、退火溫度、反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行Real－time PCR反應(yīng)，根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)果，不斷優(yōu)化反應(yīng)條件，以得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以108、107、106、105、104、103、102copies／μL 7個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，infB－F／R為引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得出各自的動力學(xué)曲線，反應(yīng)結(jié)束后由儀器軟件自動分析閾值，結(jié)合擴(kuò)增曲線計(jì)算出Ct值，自動擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出曲線的相關(guān)系數(shù)R2和PCR的擴(kuò)增效率。

1.2.4.3 熔解曲線的建立 熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，由60℃開始做熔解曲線，到95℃結(jié)束，連續(xù)收集熒光信號，以溫度為橫軸，以熒光值變化速率為縱軸建立熔解曲線。經(jīng)軟件分析后獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 以107、106、105、104、103、102、101copies／μL的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得出能檢測出陽性結(jié)果的最低稀釋度的拷貝數(shù)，同時(shí)用常規(guī)PCR對以上每個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行檢測，并比較兩種方法的敏感性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 選取108、107、106、105、104、103、102copies／μL濃度梯度的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，每個(gè)稀釋度一次進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。根據(jù)每個(gè)稀釋度的Ct值計(jì)算變異系數(shù)，確定該熒光定量PCR方法的組內(nèi)重復(fù)性。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取大腸埃希菌、巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、沙門菌等豬源性細(xì)菌的基因組，再分別取等量的且同等拷貝數(shù)的樣品DNA，以其為模板，inf B－F／R為引物，以25μL體系且相同條件進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆與鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，與p MD18－T載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，用1.2中的引物對所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，得到一條129 bp左右的DNA片段，與連接前的PCR產(chǎn)物大小一致（圖1）。將經(jīng)PCR鑒定的陽性重組菌送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，測定結(jié)果與目的片段序列完全一致。

2.2 HPS熒光定量PCR檢測方法的建立

2.2.1 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 優(yōu)化后的熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μL，其中SYBR Green real－time PCR Master mix（2×）為12.5μL，去離子水10.5μL，inf B－F、inf B－R 各0.5μL，標(biāo)準(zhǔn)模板1μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃15 s，58℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；在72℃收集熒光；95℃15 s，60℃30 s，95℃ 建立熔解曲線，1個(gè)循環(huán)；40℃10 s。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按照以上最佳的優(yōu)化條件，選 擇 108、107、106、105、104、103、102copies／μL 7個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，制作動力學(xué)曲線（圖2）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。動力學(xué)曲線的擴(kuò)增效率為1.951，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為－3.444，縱軸截距為36.63，線性方程為 Y＝－3.444X＋36.63，相關(guān)系數(shù)為0.998 8，表明線性關(guān)系很好。

圖2 熒光定量PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線／（copies·μL－1）Fig.2 Dynamic curve of fluorescent quantitative PCR（copies·μL－1）

圖3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of fluorescent quantitative PCR

2.2.3 熔解曲線的分析 熔解曲線分析可以區(qū)分非特異性擴(kuò)增，以驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性。由圖4可以看出，本試驗(yàn)的熔解曲線是單峰，表明引物的特異性很好，沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。

圖4 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR熔解曲線Fig.4 Melting curve of the SYBR Green I real－time PCR

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

通常我們認(rèn)為，模板的起始數(shù)越低Ct值則越大，當(dāng)Ct值達(dá)到35以上時(shí)，定量檢測結(jié)果是不準(zhǔn)確的。試驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR能檢測出的模板最低濃度為10 copies／μL（圖5），而常規(guī)PCR能檢測出的最低模板濃度為1.0×103copies／μL（圖6），這表明熒光定量PCR的敏感性比常規(guī)PCR高100倍。

圖5 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)／（copies·μL－1）Fig.5 Sensibility test of fluorescent quantitative PCR（copies·μL－1）

圖6 常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)／（copies·μL－1）Fig.6 Sensibility tests of routine PCR／（copies·μL－1）

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)選 取 108、107、106、105、104、103、102copies／μL的標(biāo)準(zhǔn)模板以優(yōu)化的反應(yīng)條件分別連續(xù)擴(kuò)增3次，結(jié)果顯示，每個(gè)梯度的樣本重復(fù)性很好（圖7）。同時(shí)，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于2.5%，說明該方法具有較好的重復(fù)性與穩(wěn)定性（表1）。

表1 熒光定量PCR的組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table1 Intra repeatability test of fluorescent quantitative PCR

圖7 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)Fig.7 Repeatability test of fluorescent quantitative PCR

2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果

以豬胸膜肺炎放線桿菌、豬沙門菌、豬大腸埃希菌、豬巴氏桿菌的DNA，進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果這些細(xì)菌的擴(kuò)增曲線始終沒有出現(xiàn)上揚(yáng)，幾乎為水平線，表明該方法有很好的特異性。

3 討論

在熒光定量反應(yīng)中，16 SrRNA基因不能鑒別HPS和某些同源性細(xì)菌，而inf B基因在種屬間的變異率較低且兼顧有不同血清型之間的保守序列［9］，因此本試驗(yàn)選取HPS的inf B基因中的一段高度保守的序列作為目的片段，由此保證了該檢測方法的通用性。

SYBR GreenⅠ染料可以與雙鏈DNA分子的小溝結(jié)合，其熒光強(qiáng)度的增加與雙鏈DNA的數(shù)量成正比，從而保證了熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，以達(dá)到進(jìn)行實(shí)時(shí)定量的目的。由于SYBR GreenⅠ染料與雙鏈DNA的結(jié)合沒有特異性，容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增［10］，因此，試驗(yàn)需要對熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化以增強(qiáng)檢測的特異性和準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，在退火溫度為58℃，獲得的熔解曲線只有1個(gè)特異性峰值，表明該反應(yīng)為特異性擴(kuò)增，沒有出現(xiàn)引物二聚體和其他非特異性的擴(kuò)增。

試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法運(yùn)用于檢測副豬嗜血桿菌具有快速、高效、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，并且實(shí)現(xiàn)了對模板的準(zhǔn)確定量。該方法檢測的線性范圍較寬，因此不易出現(xiàn)假陽性，在整個(gè)反應(yīng)過程中可隨時(shí)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量分析，具有無污染性和實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)，解決了常規(guī)PCR檢測方法中存在的費(fèi)時(shí)費(fèi)力、容易污染及檢測結(jié)果波動性的問題。因此，實(shí)時(shí)熒光定量檢測副豬嗜血桿菌技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］劉俊偉，安志興，葛亞明，等.副豬嗜血桿菌病的病原分離鑒定與病理學(xué)診斷［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，12（1）：111－113.

［2］司振書，王桂英.副豬嗜血桿菌病研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（6）：179－182.

［3］張培君，孫惠玲，苗得園，等.豬胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌的鑒別診斷及血清型鑒定［J］.中國獸藥雜志，2002，36（10）：18－20.

［4］Ruiz A，Oliveira S，Torremorell M，et al.Outer membrane proteins and DNA profiles in strains of Haemophilus parasuis recovered from systemic and respiratory sites［J］.Clin Microbiol，2001，39（5）：1757－1762.

［5］Jung K.Development of polymerase chain reaction and comparison with in situ hybridization for the detection of Haemophilus parasuis in formalin－fixed，paraffin－embedded tissues［J］.Vet Med Sci，2004，66：841－845.

［6］宋修慶，高宏雷，王曉艷，等.雞貧血病毒Taq Man探針熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（1）：56－59.

［7］母安雄，應(yīng)小飛，陶 益，等.副豬嗜血桿菌的研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2005，32（11）：48－49.

［8］蔡旭旺，陳煥春，劉正虼，等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（1）：55－58.

［9］于 江，吳家強(qiáng)，張玉玉，等.副豬嗜血桿菌熒光定量PCR檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，31（4）：77－81.

［10］葉曉艷.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腸道病毒方法的建立［D］.湖北武漢：華中科技大學(xué)，2009.