高效液相色譜法測(cè)定魚(yú)飼料中甲基睪丸酮含量的研究

馬 丹 高麗娜 陳永平 李春青

17α-甲基睪丸酮 (17α-methyltestosterone,MT，見(jiàn)圖1)是一種人工合成的雄激素類(lèi)藥物，具有增強(qiáng)雄性體性特征和蛋白同化雙重作用，從小喂食可以改變魚(yú)體的性別，多年來(lái)廣泛施用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的苗種培育和性別控制等方面。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，單性養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)具有魚(yú)體成活率高、產(chǎn)量高、成本消耗低、質(zhì)量?jī)?yōu)等特點(diǎn)，而雄性是單性魚(yú)體養(yǎng)殖中的最佳性別，無(wú)論在飼養(yǎng)周期、個(gè)體大小、色澤體型等方面都優(yōu)于雌性魚(yú)體，所以在魚(yú)飼料中摻入17α-甲基睪丸酮，是最快捷方便有效的雄性化魚(yú)苗的方法。應(yīng)用中最常見(jiàn)的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)就是產(chǎn)量居世界排名第二的羅非魚(yú)，隨著應(yīng)用技術(shù)的成熟，也廣泛應(yīng)用于對(duì)蝦類(lèi)、蛙類(lèi)、甲魚(yú)等養(yǎng)殖水產(chǎn)品中。但是17α-甲基睪丸酮作為雄性激素添加于飼料中被動(dòng)物攝入，如果一味追求養(yǎng)殖動(dòng)物的成熟時(shí)間而在魚(yú)體內(nèi)并未消解完全，被人類(lèi)食用而進(jìn)入人體，即使微小的含量，作為雄性激素也會(huì)對(duì)人類(lèi)的健康產(chǎn)生不利的影響，會(huì)擾亂人體內(nèi)激素平衡，引起婦女出現(xiàn)類(lèi)似早孕的反應(yīng)及乳房腫脹、不規(guī)則出血等，影響肝臟功能，導(dǎo)致新生兒畸形、溶血及黃疸等，對(duì)成人也有致癌作用。由于甲基睪丸酮有著巨大的潛在危害，歐盟95/22/EC規(guī)定禁止使用雄性激素獸藥，美國(guó)也規(guī)定其同類(lèi)的丙酸睪酮在肌肉中的最大殘留限值(MRLs)為0.64 μg/kg，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告發(fā)布的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定其為禁止使用獸藥，在所有動(dòng)物性食品的所有可食組織中不得檢出。

本文旨在建立和優(yōu)化MT在飼料中的檢測(cè)方法，利用 3β-methoxy-17β-hydroxyandrost-5-en-7-one[3β-甲基-17β-羥基-5-雄烯-7-酮，見(jiàn)圖1（2）]作為內(nèi)標(biāo)（I.S.），建立了高效液相色譜測(cè)定飼料中的17α-甲基睪丸酮方法。此方法在254 nm限定波長(zhǎng)的條件下能夠定量分析魚(yú)飼料中MT。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Aglient 1200全自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器），電子分析天平XS1050型(METTLER TOLEDO公司)，臺(tái)式離心機(jī) 3K15型(SIGMA公司)，氮吹儀N-EVPA 112型，旋渦振蕩器G560E型(Scientific Industries.Inc)，固相萃取柱 Oasis-HLB型3cc Waters公司。

1.2 藥品與試劑

17α-甲基睪丸酮(17α-methyltestosterone，純度大于99%)(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司生產(chǎn))，魚(yú)飼料，3β-甲基-17β-羥基-5-雄烯-7-酮 (I.S.)(于相關(guān)實(shí)驗(yàn)室合成，245 nm紫外波長(zhǎng)下純度＞99.5%)，甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、甲酸、乙酸（均為色譜純），純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn))。

1.3 色譜條件

WatersXterraRP18色譜柱（150mm×4.6 mm×5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm；流動(dòng)相水-乙腈(80： 20，V/V)；流速0.5 ml/min；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 10 μl。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

MT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取15.00 mg MT用甲醇定容于100 ml容量瓶中，配置成0.15 mg/ml濃度的MT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0～4℃避光儲(chǔ)存，試驗(yàn)前稀釋至不同濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

內(nèi)標(biāo)溶液：相同方法配置3.0 mg/ml濃度的內(nèi)標(biāo)溶液3β-甲基-17β-羥基-5-雄烯-7-酮，稀釋 10倍，得0.3 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.5 樣品測(cè)定

1.5.1 提取

先將魚(yú)飼料樣品粉碎過(guò)40目篩，用四分法稱(chēng)取5 g飼料樣品（精確到0.000 1 g）于50 ml聚丙烯離心管中，與外標(biāo)MT充分混勻，靜置20 min后向離心管中加入3 ml正己烷，渦旋20 s使之混合均勻，然后再依次加入 12 ml甲醇和 0.1 ml內(nèi)標(biāo)溶液（30.0 μg/ml），渦旋兩次，每次20 s，使其充分混勻，靜置后加入3 ml水，重復(fù)渦旋兩次20 s，以5 000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確吸取2 ml上層甲醇-水溶液于15 ml聚丙烯離心管中。

1.5.2 凈化

加2 ml正己烷洗滌離心管中提取液，劇烈震蕩渦旋20 s，靜置后除去正己烷層，用氮?dú)庠?0℃條件下將甲醇-水層濃縮至0.3 ml左右，加水稀釋至3 ml，將樣液全部移入預(yù)先用2 ml甲醇和2 ml水活化的固相萃取管中深層凈化，先后加入含有2%乙酸的1：1甲醇-水混合液1 ml洗滌兩次，抽干柱中溶液，再用甲醇洗滌兩次，每次加入1 ml，一齊并入15 ml聚丙烯離心管中，再加入稀釋水(4.0±0.1)ml定容到10 ml，以5 000 r/min離心5 min，取0.5 ml清液于2 ml自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

首先用甲醇提取魚(yú)飼料中的MT，其中包含樣品中的油和脂肪等成分，經(jīng)過(guò)正己烷洗滌后可除去溶解于甲醇中80%的油脂，然后將甲醇水層蒸干再加入蒸餾水移于固相萃取進(jìn)一步凈化，以水-乙腈為流動(dòng)相運(yùn)用內(nèi)標(biāo)方法測(cè)定分析魚(yú)飼料中MT的含量。

2.2 方法專(zhuān)屬性

內(nèi)標(biāo)結(jié)構(gòu)式與MT近似，其吸收峰可以清晰地與MT吸收峰區(qū)分開(kāi)（見(jiàn)圖2），是比較理想的內(nèi)標(biāo)化合物。魚(yú)飼料樣品經(jīng)過(guò)前處理，提取液不會(huì)影響MT及內(nèi)標(biāo)出峰的保留時(shí)間，MT和內(nèi)標(biāo)亦不會(huì)互相干擾。結(jié)果得出（見(jiàn)圖3、圖4），加標(biāo)樣品中內(nèi)標(biāo)和MT色譜峰的平均保留時(shí)間（n=8）分別是8.68 min(R.S.D=0.19%)和11.29 min（R.S.D=0.20%），具有較強(qiáng)專(zhuān)一性。

2.3 線性范圍及定量限

稀釋 MT儲(chǔ)備液分別配置成 7.5、15.0、30.0、45.0和60.0 μg/ml 5個(gè)系列濃度的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)液，按照1.3中色譜條件進(jìn)行分析，以樣品與內(nèi)標(biāo)面積比(X)對(duì)相應(yīng)的樣品與內(nèi)標(biāo)濃度比(Y)進(jìn)行線性擬合，擬合方程為：Y=1.276 3X+0.031 8，R2=0.999 8，在 7.5～60.0 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。本方法的定性檢出限為1.3 mg/kg（S/N=3），定量檢出限為 3.4 mg/kg（S/N=10）。

2.4 回收率

漁業(yè)養(yǎng)殖推廣技術(shù)建議魚(yú)飼料中17α-甲基睪丸酮的添加量為60 mg/kg，既可以有效地控制魚(yú)體的性別又能夠使成魚(yú)上市后在魚(yú)體內(nèi)的藥物消解完全，所以取標(biāo)準(zhǔn)添加量的25%、100%、200%作為加標(biāo)水平，即15、60、120 mg/kg。相對(duì)回收率通過(guò)內(nèi)標(biāo)來(lái)?yè)Q算，范圍在94%～100%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小值為1.97%，最大值為3.21%，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 魚(yú)飼料中17α-甲基睪丸酮的回收率（%，n=5）

2.5 準(zhǔn)確性與精密度

15、60、120 mg/kg 3個(gè)濃度的加標(biāo)水平在魚(yú)飼料樣品中17α-甲基睪丸酮檢測(cè)的批內(nèi)及批間結(jié)果考察方法的準(zhǔn)確性及精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。批內(nèi)的回收率不低于97%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.64%～2.31%之間，批間的回收率不低于98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2%。

表2 準(zhǔn)確性與精密度測(cè)定結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性

對(duì)檢測(cè)方法的細(xì)節(jié)稍作上下浮動(dòng)10%的改變來(lái)考察本方法的穩(wěn)定性，具體變量條件為：①(12.0±1.0)ml甲醇提取魚(yú)飼料中MT和內(nèi)標(biāo)；②向甲醇中加入(即增加或減少10%)的蒸餾水以去除油和脂肪；③洗滌固相萃取管中甲醇濃度變化±10%；④改變水-甲醇中加入乙酸的濃度±25%；⑤改變最后從萃取管中洗脫MT和內(nèi)標(biāo)所用的甲醇體積±10%；⑥分別使用兩種固相萃取柱填充物；⑦使用兩種填充物的反相C18柱；⑧使用不同尺寸的C18柱；⑨25℃和40℃柱溫下進(jìn)行試驗(yàn)。各做3次平行試驗(yàn)，以MT和內(nèi)標(biāo)的峰面積及比值表示結(jié)果，并用F檢驗(yàn)（ANOVA）分析判定。結(jié)果表明，前4個(gè)條件的改變對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大，固相萃取柱的更換和溫度變化亦不會(huì)使目標(biāo)物質(zhì)的峰面積和線性產(chǎn)生重大變化，MT的F檢驗(yàn)值范圍0.3～4.5，內(nèi)標(biāo)的F檢驗(yàn)值范圍0.1～2.7。唯一對(duì)本方法有影響的變量條件是洗脫固相萃取柱所用的甲醇含量，10%的變化區(qū)間對(duì)內(nèi)標(biāo)的洗脫有明顯影響，而對(duì)MT的洗脫效果改變不大，甲醇含量45%時(shí)不能使內(nèi)標(biāo)物質(zhì)全部洗脫出來(lái)，導(dǎo)致MT與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值較大；而在甲醇≥50%含量時(shí)，達(dá)到最大值，所以導(dǎo)致MT與內(nèi)標(biāo)的峰面積比有較大變化（見(jiàn)圖5）。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

漁業(yè)養(yǎng)殖推廣技術(shù)推薦雄化期用魚(yú)飼料中平均添加60 mg/kg的甲基睪丸酮含量，能夠有效地控制魚(yú)體雄性化，并能在成魚(yú)后基本消解完全。有文獻(xiàn)報(bào)道，在飼料中添加200 mg/kg質(zhì)量濃度的甲基睪丸酮，能夠起效的同時(shí)，使羅非魚(yú)在上市前體內(nèi)基本消解完全。本試驗(yàn)是對(duì)在使魚(yú)體雄變的功能性飼料中添加甲基睪丸酮含量的檢測(cè)，其較養(yǎng)殖期、上市期產(chǎn)品及非功能性飼料中的含量高出幾十倍，故前處理及檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)GB/T 22260—2008不相同，本試驗(yàn)參考美國(guó)藥典關(guān)于功能性飼料中MT的檢測(cè)方法，靈敏度范圍相對(duì)較大，相應(yīng)地，檢測(cè)值范圍也更寬闊。

3.2 甲基睪丸酮的降解

在高溫條件下，甲基睪丸酮在不同pH值環(huán)境下會(huì)降解成不同產(chǎn)物。通過(guò)UV和LC-MS（液質(zhì)聯(lián)用）的方法研究MT樣品發(fā)現(xiàn)，在甲醇-水溶液的中性環(huán)境下，升溫到70℃加熱1 h，超過(guò)98%的MT基本沒(méi)變化；在酸性條件下，得到其脫水產(chǎn)物[見(jiàn)圖6(2)]；在堿性條件下，主要的降解物為極性氧化產(chǎn)物，可能為烯丙基的氧化酮類(lèi)混合物[見(jiàn)圖6(3)]，本試驗(yàn)也對(duì)含有降解產(chǎn)物的樣品進(jìn)行檢測(cè)，得出降解產(chǎn)物對(duì)MT和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間都不會(huì)產(chǎn)生影響，所以本方法是安全可行的，在樣品成分、雜質(zhì)、降解產(chǎn)物等共同存在的混合物中能夠高度準(zhǔn)確地測(cè)定出結(jié)果。

3.3 其他動(dòng)物飼料

在觀賞魚(yú)飼料中添加甲基睪丸酮，可以使觀賞魚(yú)增色，色彩變得鮮艷亮麗；添加在貓飼料中使寵物貓皮毛鮮亮，身形矯健等，都屬于能夠增強(qiáng)動(dòng)物觀賞性的功能性飼料，如果這些飼料與上述試驗(yàn)方法中與各物質(zhì)出峰不沖突，并且含量大致在檢測(cè)范圍之內(nèi)，理論上都可以作為檢測(cè)MT的方法，這些還有待進(jìn)一步研究探索。

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