環(huán)境激素睪丸酮、孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)繁殖的影響

周西　季亞培　黃文婷

摘要：研究了在種群試驗(yàn)條件下，睪丸酮和孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生殖參數(shù)（受精率、混交雌體比率、休眠卵/雌體百分率）的影響。結(jié)果顯示，睪丸酮的48 h-EC50、NOEC、LOEC分別為511.0、0.1、1.0 μg/L。睪丸酮為10 μg/L時(shí)，可顯著誘導(dǎo)萼花臂尾輪蟲(chóng)混交雌體和休眠卵的產(chǎn)生；100、1 000 μg/L時(shí)，添加睪丸酮能使萼花臂尾輪蟲(chóng)的休眠卵孵化率分別顯著提高83.67%、85.71%；100 μg/L時(shí)，可使輪蟲(chóng)交配率提高87.5%。孕酮的48 h-EC50為4.3 mg/L，2.0 mg/L 的孕酮可使萼花臂尾輪蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)率提高20.89%；2.5 mg/L時(shí)最適宜促進(jìn)混交雌體和休眠卵的產(chǎn)生；2.5、3.0 mg/L時(shí)可使萼花臂尾輪蟲(chóng)的孵化率分別提高51.98%、1.47倍；3.0、3.5 mg/L時(shí)可顯著提高輪蟲(chóng)受精率。

關(guān)鍵詞：萼花臂尾輪蟲(chóng)；睪丸酮；孕酮；混交雌體；生殖參數(shù)

中圖分類號(hào)： X171.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0286-04

萼花臂尾輪蟲(chóng)（Brachionus calyciflorus）具有分布廣、繁殖快、易培養(yǎng)等特點(diǎn)，是淡水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其休眠卵可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。20世紀(jì)70年代，輪蟲(chóng)被推薦作為生態(tài)毒理受試動(dòng)物[1]；20世紀(jì)90年代，萼花臂尾輪蟲(chóng)、褶皺臂尾輪蟲(chóng)（Brachionus plicatilis）分別被美國(guó)試驗(yàn)材料協(xié)會(huì)（American Society for Testing and Materials，ASTM）采納，正式成為淡水、海水生態(tài)毒理研究的標(biāo)準(zhǔn)受試動(dòng)物[2]。甲基睪丸酮、孕酮是由脊椎動(dòng)物分泌的類固醇激素，進(jìn)入水體中會(huì)對(duì)生物內(nèi)分泌產(chǎn)生干擾。輪蟲(chóng)受精和休眠卵產(chǎn)量等受內(nèi)分泌機(jī)制的調(diào)控，因此其生殖指標(biāo)可作為測(cè)定環(huán)境激素對(duì)水生無(wú)脊椎動(dòng)物內(nèi)分泌干擾的有效方法。已有研究證實(shí)，輪蟲(chóng)的生長(zhǎng)生殖可受一些環(huán)境激素的影響[3-4]。一定濃度孕酮可增加臂尾輪蟲(chóng)（Brachionus manjavacas）產(chǎn)休眠卵的數(shù)量并明顯降低其內(nèi)稟增長(zhǎng)率[5]。氰戊菊酯（fenvalerate）、三丁基氯化錫（TBTC）對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生命周期中各發(fā)育階段歷時(shí)和種群增長(zhǎng)均有顯著影響[6]。然而，已有研究多建立在環(huán)境效應(yīng)藥物上，即具有雌性或雄性效應(yīng)的藥物，而關(guān)于外源性哺乳動(dòng)物分泌的性激素對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生長(zhǎng)生殖的影響鮮有報(bào)道。研究在睪丸酮、孕酮等典型類固醇激素作用下萼花臂尾輪蟲(chóng)生殖情況的變化，并分析各種參數(shù)，尋找性激素對(duì)輪蟲(chóng)生殖干擾的參考指標(biāo)，以期為輪蟲(chóng)繁殖生物學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)的結(jié)合提供新的研究思路。尋求適當(dāng)?shù)募に卮碳?，以促進(jìn)輪蟲(chóng)由無(wú)性生殖向有性生殖轉(zhuǎn)化，從而提高其休眠卵產(chǎn)量，在生產(chǎn)中具有實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 輪蟲(chóng)的預(yù)培養(yǎng)

試驗(yàn)采用萼花臂尾輪蟲(chóng)（Florida，USA，1983品系）的冷凍休眠卵，于24孔塑料培養(yǎng)板中孵化，每孔加入0.8 mL EPA培養(yǎng)基[7]（蛋白核小球藻的濃度控制在3.0×106～3.5×106 個(gè)/mL），進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。挑取齡期小于4 h且活潑健壯的新生幼體進(jìn)行試驗(yàn)。輪蟲(chóng)的培養(yǎng)條件為光照度約4 000 lx、光—暗周期16 h—8 h、溫度（25±1） ℃。

1.2 試驗(yàn)藥品的配制

采用丙酮溶液作為溶劑，分別將甲基睪丸酮、孕酮配制為10 000 mg/L的母液。將EPA培養(yǎng)基和濃縮離心后的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）（HB4培養(yǎng)基）配制為不同濃度梯度的試驗(yàn)溶液，小球藻濃度控制在約4×106 cells/mL，小球藻培養(yǎng)條件與楊家新等的培養(yǎng)條件[8]相同。

1.3 相關(guān)試驗(yàn)參數(shù)和計(jì)算方法

種群增長(zhǎng)率：r=（lnNt-lnN0）/T（Nt為種群在t d時(shí)的種群數(shù)量，N0為起始數(shù)量，T為試驗(yàn)時(shí)間）。混交雌體與非混交雌體比：MF/AF=混交雌體數(shù)/非混交雌體數(shù)。攜卵與非攜卵比：OF/NOF=攜卵/非攜卵（ovigerous female/non-ovigerous）?；旖话俜致剩篗F=MF/（MF+MPF+AF）×100%（MF為混交雌體，AF為非混交雌體，MPF為產(chǎn)雄雌體）。受精百分率：受精百分率=產(chǎn)休眠卵/總混交雌體。受精率：受精率=攜休眠卵雌體數(shù)/總雌體數(shù)。交配率：交配率=雄體相遇次數(shù)/（雄體相遇次數(shù)+成功交配次數(shù)）[9]。

1.4 種群動(dòng)態(tài)學(xué)試驗(yàn)

取齡期小于4 h的輪蟲(chóng)幼體置于試管（直徑1 cm、長(zhǎng)度10 cm）中，4個(gè)/管，加入8 mL不同質(zhì)量濃度的試驗(yàn)溶液（甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為0.1、1、10、100、1 000 μg/L，孕酮質(zhì)量濃度分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L），每組設(shè)置5個(gè)平行組，另設(shè)1個(gè)空白組。每隔24 h振蕩試管，使藻液分散均勻。于48 h時(shí)計(jì)數(shù)，并計(jì)算種群增長(zhǎng)率和EC50值。于 96 h 時(shí)分別對(duì)非混交雌體、攜雄卵雌體、攜休眠卵雌體、非攜卵雌體、休眠卵進(jìn)行計(jì)數(shù)，類別鑒定方法與Paloheimo的方法[10]相同。7 d后對(duì)各質(zhì)量濃度組試管底部的休眠卵進(jìn)行計(jì)數(shù)并收集，風(fēng)干后放入1 mL EPA Eppendorf離心管中，置于 4 ℃ 冰箱。30 d后取出該休眠卵置于6孔塑料培養(yǎng)板中孵化，置入30個(gè)/孔，加入5 mL EPA培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個(gè)平行組，連續(xù)觀察并計(jì)算孵化率。試驗(yàn)過(guò)程中不更換培養(yǎng)溶液。

1.5 受精率試驗(yàn)

對(duì)輪蟲(chóng)進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，從中挑取出8～9個(gè)2～4 h齡的非混交雌體以及剛產(chǎn)出的雄體，分別按照雌雄性比1 ∶ 2放入05 mL不同質(zhì)量濃度的試驗(yàn)溶液中，于24孔板中培養(yǎng)。睪丸酮的質(zhì)量濃度分別為1、5、25、125、625 μg/L，孕酮的質(zhì)量濃度分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L。每組設(shè)3個(gè)平行組，另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組。試驗(yàn)開(kāi)始24 h后移去雄體，之后每隔8 h移去攜非混交卵的雌體、產(chǎn)雄卵的混交雌體，保留產(chǎn)休眠卵的雌體，并于試驗(yàn)進(jìn)行72 h后統(tǒng)計(jì)攜休眠卵的雌體數(shù)和總雌體數(shù)。試驗(yàn)過(guò)程中每隔12 h更換1次培養(yǎng)溶液。

1.6 受精行為觀察

隨機(jī)挑取齡期小于4 h的非混交雌體和剛產(chǎn)出的雄體，分別放入不同質(zhì)量濃度的藥物（睪丸酮、孕酮質(zhì)量濃度同“15”節(jié)）中，不添加任何藻液。每組設(shè)5個(gè)平行組及1個(gè)對(duì)照組，置于96孔板中培養(yǎng)，反應(yīng)體系控制在100 μL以內(nèi)。在室溫（23～25 ℃）下通過(guò)解剖鏡連續(xù)觀察20 min，根據(jù)Snell等的試驗(yàn)方法[5]記錄雌體和雄體相遇次數(shù)及成功交配次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸酮、孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)2 d種群增長(zhǎng)率的影響

由圖1可知，睪丸酮、孕酮均對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的增長(zhǎng)率具有顯著影響（LSD，F(xiàn)=24.877，df組間=5，df組內(nèi)=24，P

與對(duì)照組相比，3～4 mg/L孕酮組的種群增長(zhǎng)率降低，4 mg/L 孕酮組的種群增長(zhǎng)率下降了38.40%，差異顯著（Dunnett檢驗(yàn)，P<0.01）。Prohit分析得到孕酮的

EC50為4.3 mg/L。

2.2 睪丸酮、孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)4 d種群動(dòng)態(tài)學(xué)的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1、表2）表明，睪丸酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的MF/AF、混交率、7 d休眠卵產(chǎn)量、休眠卵/雌體比均具有極顯著影響（LSD，F(xiàn)值分別為4.285、4.379、4.493、4.165，df組間均為5，df組內(nèi)均為24，P均小于0.01），對(duì)受精率也具有顯著影響（LSD，F(xiàn)=2.749，df組間=5，df組內(nèi)=24，P005），孕酮對(duì)受精率的影響也不顯著（F=0.177，df組間=5，df組內(nèi)=24，P>0.05）。

2.3 睪丸酮和孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)休眠卵孵化率的影響

由圖2可知，睪丸酮和孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)休眠卵的孵化率均具有極顯著影響（F分別為7.28、31.28，df組間=5，df組內(nèi)=24，P<0.05），呈先升高后降低的趨勢(shì)。

2.4 睪丸酮、孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)受精作用的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，睪丸酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)混交雌體的受精率沒(méi)有顯著影響（LSD，F(xiàn)=2.21，df組間=5，df組內(nèi)=138，P>0.05），而孕酮對(duì)輪蟲(chóng)受精率的影響極顯著（LSD，F(xiàn)=379，df組間=5，df組內(nèi)=90，P<0.01），大致呈拋物線形。

2.5 睪丸酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)雄體交配行為的影響

由圖4可知，在睪丸酮的影響下，雄體的交配行為差異極顯著（LSD，F(xiàn)=6.93，df=24，P<0.05）。隨著質(zhì)量濃度的增加交配率明顯降低，表明雄性激素可提高雄體交配率。

3 結(jié)論與討論

3.1 睪丸酮、孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)的影響

目前，關(guān)于外源雄性激素對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生殖影響的報(bào)道較少，多數(shù)集中于環(huán)境雌激素對(duì)輪蟲(chóng)生殖生理的影響。Radix 等研究發(fā)現(xiàn)，萼花臂尾輪蟲(chóng)的睪丸酮72 h-EC50為 26.3 μmol/L[11]，而本試驗(yàn)中得出的睪丸酮48 h-EC50約為511 μg/L，可能是由于不同品系的萼花臂尾輪蟲(chóng)存在一定差異。本試驗(yàn)中睪丸酮質(zhì)量濃度為1～1 000 μg/L時(shí)，內(nèi)稟增長(zhǎng)率r大幅下降，與Radix等發(fā)現(xiàn)的r值在0.58 μmol/L睪丸酮刺激下發(fā)生下降[11]相似。Snell等研究表明，孕酮質(zhì)量濃度低于10 mg/L時(shí)對(duì)臂尾輪蟲(chóng)Brachionus manjavacas種群增長(zhǎng)無(wú)顯著影響，高于14 mg/L時(shí)可對(duì)其產(chǎn)生抑制，而12 mg/L孕酮對(duì)海水種褶皺臂尾輪蟲(chóng)（B. plicatilis）無(wú)顯著影響，表明高濃度環(huán)境激素對(duì)輪蟲(chóng)產(chǎn)生一定毒性效應(yīng)[5]。本試驗(yàn)得到了相似結(jié)果，在2.0～2.5 mg/L時(shí)r值下降，可能是由于投喂食物的濃度和種類不同，對(duì)輪蟲(chóng)種群數(shù)量具有不同程度的影響。

3.2 睪丸酮和孕酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)混交雌體的促進(jìn)作用

本試驗(yàn)中，睪丸酮在EC50值附近對(duì)MF/AF和MF%值均具有顯著影響，在0.1～100 μg/L范圍內(nèi)混交雌體比率上升，以r值為指標(biāo)得出的EC50值與群體條件下得出的MF%、MF/AF 值具有一定的計(jì)量-效應(yīng)關(guān)系，呈拋物線形；但對(duì)于 OF/NOF 值沒(méi)有顯著影響?？梢?jiàn)，r值并不是判斷睪丸酮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生殖影響的理想指標(biāo)，但該值仍是敏感的檢測(cè)指標(biāo)[12-14]。孕酮對(duì)混交雌體也有類似的促進(jìn)作用，表明類固醇激素對(duì)輪蟲(chóng)內(nèi)分泌產(chǎn)生干擾，刺激無(wú)性生殖向有性生殖轉(zhuǎn)變，從而促發(fā)大量混交雌體的產(chǎn)生。

3.3 類固醇激素對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)休眠卵生成和孵化的影響

Gallardo等在萼花臂尾輪蟲(chóng)的群體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，0.05、050 mg/L保幼激素（JH）刺激可將混交雌體發(fā)生率提高30%[15]。本研究表明，10、100 μg/L睪丸酮和2.0、2.5 mg/L孕酮可促進(jìn)萼花臂尾輪蟲(chóng)休眠卵的產(chǎn)生。可能是由于在類固醇激素的作用下混交雌體大量出現(xiàn)，產(chǎn)雄雌體相對(duì)增加，藥物對(duì)雄體、產(chǎn)雄雌體內(nèi)分泌產(chǎn)生干擾，使雄體活力增強(qiáng)、受精率提高，進(jìn)而影響卵雌比。

Snell發(fā)現(xiàn)孕酮對(duì)B. manjavacas休眠卵的孵化率具有明顯影響，而對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)無(wú)影響，本試驗(yàn)結(jié)果與之不一致，可能是由于休眠卵萌發(fā)也受到母體攝食類型的影響。在萼花臂尾輪蟲(chóng)對(duì)淡水水體中內(nèi)分泌干擾物和重金屬的研究中發(fā)現(xiàn)，輪蟲(chóng)在有性生殖階段對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)比無(wú)性生殖階段更敏感[16]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)于環(huán)境激素中的雌性激素（孕酮）和外源性的雄性激素（睪丸酮），休眠卵的孵化率是評(píng)價(jià)水體中內(nèi)分泌干擾物的良好指標(biāo)；加入此類性激素可在不破壞生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)上對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)休眠卵的產(chǎn)生、孵化率的提升具有促進(jìn)作用，在實(shí)際生產(chǎn)中具有一定利用價(jià)值。

3.4 環(huán)境激素對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)有性生殖階段中受精率和受精行為的影響

目前對(duì)輪蟲(chóng)交配行為的研究主要集中于萼花臂尾輪蟲(chóng)屬[17-18]，而對(duì)于不同環(huán)境激素作用下輪蟲(chóng)受精作用的研究較少。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在雌雄性比相同時(shí)，睪丸酮對(duì)輪蟲(chóng)混交雌體的受精率無(wú)顯著影響，而一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的孕酮可顯著提高受精率，促進(jìn)輪蟲(chóng)交配行為的發(fā)生。Snell等研究發(fā)現(xiàn)，橈足類個(gè)體交配行為的發(fā)生依賴于水體中物種特異性接觸的信息素類物質(zhì)[19]，輪蟲(chóng)交配行為的發(fā)生與其類似。雄體通過(guò)頭冠上的受體來(lái)獲取雌體表面糖蛋白的化學(xué)信息，交配行為受到信號(hào)質(zhì)量和強(qiáng)度的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，睪丸酮在100 μg/L時(shí)顯著提高輪蟲(chóng)的交配率，因此認(rèn)為水體中性激素的存在干擾了自然的信息素，使雄體表現(xiàn)出不同程度的交配行為。雄體交配率的高低與最終混交雌體產(chǎn)生休眠卵的高低之間沒(méi)有數(shù)量級(jí)關(guān)系，表明休眠卵的產(chǎn)生與交配次數(shù)無(wú)關(guān)，而可能與性激素對(duì)雌體內(nèi)分泌系統(tǒng)的干擾有關(guān)。關(guān)于這種信息素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、是否真實(shí)存在或被提取并無(wú)定論[20-22]，性激素的存在是否真正影響到此類物質(zhì)，或直接對(duì)雄體的生理生化反應(yīng)產(chǎn)生影響，有待借助分子生物學(xué)手段進(jìn)一步研究。

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