固相萃取偶聯(lián)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定鹿血中睪丸酮的含量

胡春蘭 陳媛媛 王春民 任貴奇▲

1.頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北承德 067000；2.河北省中藥新輔料技術(shù)創(chuàng)新中心，河北承德 067000

鹿血系鹿科動(dòng)物梅花鹿（Cervus nippon）和馬鹿（Cervus elaphus）的血液，具有養(yǎng)血益精、行血祛瘀、消腫等功效。因其資源稀缺，所以“以次充好、假冒偽劣”等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[1-5]。睪丸酮作為鹿血中的有效成分之一，具有維持肌肉強(qiáng)度及質(zhì)量、維持骨質(zhì)密度及強(qiáng)度、提神及提升體能等作用。通過(guò)測(cè)定鹿血中的睪丸酮含量，能在一定程度上評(píng)價(jià)鹿血的品質(zhì)[6]。由于鹿血中甾體類化合物的研究比較少，作為甾體類化合物的睪丸酮分離、結(jié)構(gòu)鑒定僅限于使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]。但是HPLC測(cè)靈敏度低，抗干擾能力差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有定性能力強(qiáng)，檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)[9-12]，其能夠利用四級(jí)桿檢測(cè)器克服基質(zhì)干擾，有更好的分辨率、更高的靈敏度、具有很強(qiáng)的定性定量能力[13-14]。有效的樣品前處理對(duì)于定性定量分析的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，固相萃取作為前處理方法，具有便捷、高效等優(yōu)點(diǎn)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)采用兩步提取、兩步萃取的方法提取和凈化鹿血中的睪丸酮，旨在建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定睪丸酮的含量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Triple-TOF 4600 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（AB SCIEX）；Centrifuge 5424 離心機(jī)（Eppendorf）；12 孔固相萃取儀（CNW Technologies GmbH）；RE-5286A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋儀（IKA）；0.22 μm 微孔濾膜（Sartorius Stedim Biotech GmbH）。

1.2 材料

鹿血（批號(hào)：B1501、B1502、B1503、B1504，采集自河北省承德市承德縣鹿養(yǎng)殖場(chǎng)梅花鹿，鹿血樣品符合《鹿副產(chǎn)品》[17]中關(guān)于鹿血的各項(xiàng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求）；氮?dú)猓üI(yè)氮，承德燕山氣體有限公司）；乙腈、提取甲醇、正己烷、乙酸乙酯（天津歐博凱化工有限公司）；液質(zhì)甲醇（美國(guó)Fisher 公司）；水（屈臣氏飲用水）；睪丸酮對(duì)照品（批號(hào)：KBBCT12；CAS：58-22-0；98%北京伊諾凱科技有限公司）；SAX SPE 柱（最大上樣量：500 mg，體積：3 mL，Part No.：63404，DIKMA）；Florisil SPE 柱（最大上樣量：500 mg，體積：3 mL，Part No.：65004，DIKMA）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 條件與質(zhì)譜條件

HPLC 色譜柱：shim-Pack XR-ODS（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫（0～1 min，10%A；1～6 min，10%A→90%A；6～10 min，90%A；10～10.1 min，90%A→10%A；10.1～15 min，10%A）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；正離子掃面；多重反應(yīng)檢測(cè)（multiple reaction detection，MRM）；去簇電壓（de-clustering voltage，DP）為60.0 V；碰撞能（collision energy，CE）為10.0 eV。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品制備方法 取120 mL 的批號(hào)B1501 鹿血，加入80 mL 乙腈，超聲20 min（功率150 W，頻率40 kHz），離心2 min（3800 r/min，離心半徑8.4 cm），取上清液，重復(fù)提取兩次；提取液減壓濃縮至近干，加入10 mL NaCl 溶液（0.25 g/mL）。50 mL 乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3 次，合并萃取液，減壓濃縮至近干；加5 mL 甲醇溶解，導(dǎo)入離心管A 中，加入5 mL 水，待過(guò)柱凈化。

SAX 固相萃取柱以2 mL 甲醇、2 mL 50%甲醇溶液依次活化平衡，離心管A 中樣品上柱，離心管A 用2 mL 50%甲醇溶液洗滌后上柱，合并濾液導(dǎo)入離心管B。離心管B 中樣品50℃水浴并用氮?dú)獯抵翢o(wú)醇味。加3 mL 正己烷，渦旋，靜置，取上清液，重復(fù)3 次，合并萃取液至離心管C。Florisil 固相萃取柱以4 mL乙酸乙酯，4 mL 正己烷依次活化平衡，離心管C 中萃取液過(guò)柱，流速不超過(guò)2 滴/s，離心管C 用2 mL 乙酸乙酯-正己烷（10∶90，V/V）洗滌后上柱，棄洗脫液。用4 mL 乙酸乙酯-正己烷（60∶40，V/V）洗脫柱子，重復(fù)兩次。洗脫液導(dǎo)入離心管D，50℃水浴并用氮?dú)獯抵粮?。? mL 50%甲醇溶解，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜得供試品溶液。所得圖譜見(jiàn)圖1、2。

圖1 B1501 批鹿血樣品中睪丸酮的二級(jí)掃描色譜圖

2.2.2 對(duì)照品制備方法 取睪丸酮對(duì)照品適量，精密稱定，置1.5 mL 離心管中，加1 mL 甲醇，搖勻，作為母液，精密量取100 μL 母液，置1.5 mL 離心管中，加900 μL 甲醇，制成濃度為30.33 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。所得圖譜見(jiàn)圖3、4。

圖3 睪丸酮對(duì)照品的二級(jí)掃描色譜圖

圖2 B1501 批鹿血樣品中睪丸酮質(zhì)譜圖

圖4 睪丸酮對(duì)照品的質(zhì)譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的睪丸酮儲(chǔ)備液，甲醇定容，制成濃度分別為1.5165×10-4、3.033×10-4、1.5165×10-3、3.033×10-3、1.5165×10-2、3.033×10-2、1.5165×10-1、3.033×10-1μg/mL 溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件下進(jìn)樣，97.06 和109.06 兩個(gè)子離子中，子離子109.06 的響應(yīng)值略大，更穩(wěn)定，所以選做定量子離子。計(jì)算定量子離子109.06 的峰面積。

子離子109.06 的峰面積（Y）和濃度（X）的線性關(guān)系為：Y=145 051X+2694.6，R=0.9995。

定量子離子109.06 的R 值>0.999，表明睪丸酮在1.5165×10-4～3.033×10-1μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4 精密度考察

取1.5165×10-1μg/mL 濃度的睪丸酮對(duì)照品在“2.1”條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次。109.06（子離子）*和97.06（子離子）峰面積的RSD值分別為4.07%、4.12%，RSD<15%，提示儀器精密度良好（*是定量子離子）。

2.5 重復(fù)性考察

按“2.2.1”項(xiàng)制備的供試品溶液，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次，按照“2.1”條件下分別進(jìn)樣。109.06（子離子）*和97.06（子離子）峰面積的RSD值分別為13.71%、13.14%，RSD<15%，提示重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取120 mL 批號(hào)B1501 的鹿血，按“2.2.1”項(xiàng)制備供試品溶液，分別在0.5、1、2、4、6、24 h 時(shí)間按照“2.1”條件進(jìn)樣。109.06（子離子）* 和97.06（子離子）峰面積的RSD值分別為7.90%、9.40%，RSD<15%，提示供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率考察

采用加樣回收法，精密量取120 mL 批號(hào)B1501的鹿血（109.06 子離子測(cè)得含睪丸酮濃度為3.32×10-4μg/mL，睪丸酮含量為4.0×10-2μg），加入1 mL濃度為4.033×10-2μg/mL 的睪丸酮對(duì)照品，混勻。按“2.2.1”項(xiàng)制備供試品溶液，進(jìn)行6 次，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，測(cè)定109.06 子離子的峰面積，分別計(jì)算子離子的平均回收率和RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，本研究中，以109.06 為定量子離子的睪丸酮平均加樣回收率為66.62%。由于在基質(zhì)復(fù)雜、含量低于0.01%分析中，回收率標(biāo)準(zhǔn)可適當(dāng)放寬，可以低于70%，符合2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》四部[18]的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 以109.06 為定量子離子的睪丸酮加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.8 鹿血中睪丸酮的測(cè)定

B1501、B1502、B1503、B15044 個(gè)批次的鹿血，分別取120 mL，每批次平行實(shí)驗(yàn)4 次，按“2.2.1”項(xiàng)制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，計(jì)算每個(gè)批次平均睪丸酮含量及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，四個(gè)批次鹿血中睪丸酮含量范圍為3.30×10-4～3.48×10-4μg/mL，RSD均<3%。

表2 四個(gè)批次鹿血中睪丸酮的含量（n=4）

3 討論

對(duì)本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的提取溶劑進(jìn)行了考察。最初選用甲醇萃取鹿血中的睪丸酮，結(jié)果雜質(zhì)較多，后用乙腈先沉淀蛋白，再用乙酸乙酯萃取其中睪丸酮。兩步萃取不僅增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜程度，還增大了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中睪丸酮樣品的損失，降低了加樣回收率。但是大大降低檢測(cè)時(shí)雜質(zhì)的影響，增加了實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

對(duì)本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用固相萃取柱的考察。主要考察了酸性氧化鋁固相萃取柱、C18固相萃取柱、SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱。單一固相萃取柱不能降低基質(zhì)效應(yīng)，于是選用兩種固相萃取柱聯(lián)用法。通過(guò)文獻(xiàn)得出[19-21]，酸性氧化鋁固相萃取柱、C18固相萃取柱和SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱兩種萃取柱組合方法。都能降低基質(zhì)效應(yīng)的前提下，采用回收率法優(yōu)選兩種萃取柱組合，SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱組合優(yōu)于酸性氧化鋁固相萃取柱、C18固相萃取柱組合。

對(duì)本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的色譜溶劑進(jìn)行了考察。從甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水兩種色譜溶劑組合中優(yōu)選，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,甲醇-0.1%甲酸水色譜溶劑結(jié)果更穩(wěn)定，得出的峰型相對(duì)更好。

對(duì)本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜條件中的DP 和CE 值進(jìn)行了優(yōu)選。采用動(dòng)態(tài)掃描優(yōu)選DP 和CE 值。隨著DP 和CE值的增大，子離子量增大，母離子量減小。選取子離子和母離子量合適時(shí)的DP 和CE 值。

睪丸酮作為鹿血改善性功能的主要有效成分[22]，測(cè)定其含量能評(píng)價(jià)鹿血的質(zhì)量。單一檢測(cè)鹿血中睪丸酮含量作為鹿血的質(zhì)量評(píng)價(jià)條件，不能全面評(píng)價(jià)鹿血的質(zhì)量，如果加入指紋圖譜法能更全面的評(píng)價(jià)鹿血的優(yōu)劣，這是本課題的下一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)固相萃取偶聯(lián)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法法測(cè)定鹿血中睪丸酮的含量，經(jīng)方法學(xué)研究結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，回收率達(dá)標(biāo)。綜上所述，本研究建立方法的結(jié)果可靠，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，能夠?yàn)楦玫乜刂坡寡|(zhì)量提供參考。