HPLC法測(cè)定新疆準(zhǔn)噶爾烏頭中雙酯型生物堿

趙翡翠， 何 強(qiáng)， 李 杰

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊 830000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054)

準(zhǔn)噶爾烏頭為毛茛科植物準(zhǔn)噶爾烏頭Aconitum soongaricumStapf的干燥塊根，主要產(chǎn)于我國(guó)新疆北疆地區(qū)，民間常做草烏的代用品使用，味辛、苦，大熱，有毒，具祛風(fēng)散寒、止痛消腫、通經(jīng)活絡(luò)的功效［1］。新疆地域遼闊，干旱高寒，生態(tài)環(huán)境惡劣，使風(fēng)濕類(lèi)疾病成為新疆地區(qū)常見(jiàn)病、多發(fā)病，且纏綿難愈，準(zhǔn)噶爾烏頭在治療此類(lèi)疾病方面，有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［2］。同時(shí)，準(zhǔn)噶爾烏頭也是近年來(lái)生長(zhǎng)于新疆草場(chǎng)的主要毒害草之一，已對(duì)新疆畜牧業(yè)造成較大的危害。因此，有必要盡快對(duì)準(zhǔn)噶爾烏頭的藥用價(jià)值進(jìn)行研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3-4］，準(zhǔn)噶爾烏頭中含有準(zhǔn)噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿及12-表-脫氫歐烏堿，而準(zhǔn)噶爾烏頭是否含有大多數(shù)烏頭屬植物中所含的活性成分——雙酯型生物堿 (烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿)尚未見(jiàn)報(bào)道，這將使進(jìn)一步研究準(zhǔn)噶爾烏頭炮制減毒、藥理作用受到很大程度的限制。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法測(cè)定準(zhǔn)噶爾烏頭中的活性成分，為新疆準(zhǔn)噶爾烏頭藥用植物資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀 (美國(guó)Waters公司);AG—135電子分析天平 (梅特勒-托利多儀器有限公司);SK3300LH超聲清洗器 (上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);Direct—QTM5超純水儀(Millipore公司)。烏頭堿 (批號(hào)110720-200410)、新烏頭堿 (批號(hào)110799-200404)和次烏頭堿 (批號(hào)110798-200404)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，其他試劑均為分析純。

川烏樣品分別購(gòu)自安徽省亳州市雙華中藥飲片廠 (批號(hào)101001，產(chǎn)地:四川)、安徽省亳州市凱利中藥飲片有限公司 (批號(hào)091210，產(chǎn)地:四川)、新疆奇康哈博維藥有限公司 (批號(hào)20110501，產(chǎn)地:四川)，以上樣品經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室李永和主任中藥師鑒定均為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的干燥母根。

準(zhǔn)噶爾烏頭樣品于2010至2011年分別采自新疆伊犁地區(qū)尼勒克、新源、特克斯等不同產(chǎn)地，共6批。以上樣品經(jīng)李永和主任中藥師鑒定均為毛茛科植物準(zhǔn)噶爾烏頭Aconitum soongaricumStapf.的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用X Bridge C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-水-三氯甲烷 (濃氨水調(diào)節(jié)pH為10.62)(70∶30∶2)為流動(dòng)相，體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。結(jié)果供試品及對(duì)照品色譜分離度良好，見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解并定容至刻度，搖勻，得烏頭堿質(zhì)量濃度為0.201 2 mg/mL，新烏頭堿質(zhì)量濃度為0.043 2 mg/mL，次烏頭堿質(zhì)量濃度為0.041 9 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末 (粉碎后過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加10%氨試液4 mL，濕潤(rùn)，精密加入乙醚20 mL，超聲處理 (功率300 W，頻率40 kHz;水溫在25℃以下)10 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用乙醚補(bǔ)足減失的質(zhì)量，放置過(guò)夜，濾過(guò)，并用10 mL乙醚分3次洗滌藥渣，合并濾液，置50℃水浴揮干，殘?jiān)枚燃淄槿芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加二氯甲烷至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各 0.5、5、10、20、30、40、50、60、70 μL，分別測(cè)定峰面積積分值。以烏頭堿對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得烏頭堿回歸方程y=363 962x+210 563，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。再分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各1、2、4、6、8、10、12 μL，分別測(cè)定峰面積積分值。分別以新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得新烏頭堿回歸方程y=899 741x+305 2.5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9;得次烏頭堿回歸方程y=1 478 609.13x-30 112.29，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。表明，烏頭堿進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.100 6～14.084 0 mg/mL、新烏頭堿進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.043 2～0.518 4 mg/mL、次烏頭堿進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.041 9～0.502 8 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為 0.71%、0.97%、1.02%，表明精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液 (2010年，尼勒克縣)，精密吸取，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每隔2 h進(jìn)樣一次，共考察8 h，結(jié)果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為0.75%、0.82%、1.45%，表明供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取本品6份 (2010年，尼勒克縣)，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.531 1 mg/g，0.136 8 mg/g和 0.128 3 mg/g，RSD分別為1.25%，1.75%和1.70%。表明重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知量準(zhǔn)噶爾烏頭樣品(2010年，尼勒克縣)6份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，每份分別加入2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各1 mL，按2.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～3。表明本測(cè)定方法的回收率較好。

表1 烏頭堿加樣回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 Recovery results of aconitine

表2 新烏頭堿加樣回收率測(cè)定結(jié)果Tab.2 Recovery results of hypaconitine

表3 次烏頭堿加樣回收率測(cè)定結(jié)果Tab.3 Recovery results of mesaconitine

3 樣品的測(cè)定

分別取不同產(chǎn)地和批次的準(zhǔn)噶爾烏頭和川烏樣品，按2.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.4 Determination of contents(n=3)

4 討論

4.1 由于準(zhǔn)噶爾烏頭與川烏為同屬植物［6］，所以本實(shí)驗(yàn)測(cè)定準(zhǔn)噶爾烏頭中雙酯型生物堿時(shí)先參照《中國(guó)藥典》2010年版一部川烏項(xiàng)下的HPLC方法進(jìn)行［5］，結(jié)果圖譜分離效果不理想，對(duì)照品圖譜分離效果也較差。因此，參考文獻(xiàn) ［7-10］對(duì)供試品前處理方法 (包括藥材粉碎粒度、藥材取樣量、提取溶劑、提取方法)和流動(dòng)相 ［分別采用甲醇-水-乙腈 (67 ∶33 ∶2)、甲醇-水-三氯甲烷-氨水(70∶30∶2∶0.1)、甲醇-0.3%三乙胺-三氯甲烷(69∶30∶1)、乙腈-0.04 mol/L三乙胺 (pH3)(35∶65)、乙腈-四氫呋喃 (25∶15)A-0.1 mol/L乙酸銨溶液 (每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)B等不同流動(dòng)相］進(jìn)行了考察，又對(duì)初步確定的流動(dòng)相的比例進(jìn)行了調(diào)整，最終確定了峰形較好、分離度較好的色譜條件和供試品前處理方法。

4.2 目前關(guān)于準(zhǔn)噶爾烏頭的研究報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法可同時(shí)測(cè)定準(zhǔn)噶爾烏頭中3種雙酯型生物堿 (烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿)，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明該法簡(jiǎn)便、可行。

4.3 根據(jù)6批不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)期的準(zhǔn)噶爾烏頭樣品測(cè)定結(jié)果表明，本品與已有法定藥材標(biāo)準(zhǔn)的川烏同樣含有雙酯型生物堿 (烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿)，其中烏頭堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于川烏藥材約24倍 (取不同產(chǎn)地的平均值)，新烏頭堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為川烏藥材的1/2，次烏頭堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為川烏藥材的1/3，表明新疆準(zhǔn)噶爾烏頭中烏頭堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，應(yīng)具有抗炎鎮(zhèn)痛、對(duì)免疫系統(tǒng)影響等藥用價(jià)值［11-12］，但其與川烏所含的雙酯型生物堿各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差較大，其確切的藥理作用和毒性，以及與川烏藥材的親緣性仍有待進(jìn)一步深入研究。

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