花生及其制品中多種霉菌毒素殘留同時(shí)測(cè)定方法*

朱臻怡 ，宋歡 ，馮民 ，何健 ，熊華萱

(1中華人民共和國淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇淮安 223001；2中華人民共和國山西出入境檢驗(yàn)檢疫局，太原 030024)

霉菌毒素(Mycotoxins)是一類存在于自然界中的各種霉菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛污染農(nóng)作物、食品及飼料等植物源性產(chǎn)品[1]，是花生及其制品的重要污染源之一，從而進(jìn)入食物鏈中影響人體健康[2]。隨著農(nóng)產(chǎn)品受霉菌毒素污染問題的日趨嚴(yán)重和食品安全問題的國際化，發(fā)達(dá)國家和有關(guān)組織對(duì)花生及其制品中霉菌毒素殘留紛紛制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[3]?；ㄉ鳛槲覈趪H市場(chǎng)具有相對(duì)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的農(nóng)產(chǎn)品，其出口遭受到了一系列SPS措施的阻礙[4]，其中霉菌毒素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)日趨嚴(yán)厲，檢測(cè)項(xiàng)目不斷增加。因此花生及其制品中霉菌毒素殘留檢測(cè)對(duì)于保障人民飲食健康，保障我國花生及其制品的進(jìn)出口貿(mào)易具有重要意義。

目前在我國，霉菌毒素是出口花生及其制品的殘留監(jiān)控的一個(gè)重要項(xiàng)目[5]，對(duì)于霉菌毒素的殘留分析，國內(nèi)外報(bào)道較多的是僅針對(duì)每個(gè)毒素的包括薄層層析法、液相色譜法和免疫化學(xué)分析法(有免疫親和柱-熒光分光光度法和免疫親和術(shù)-HPLC法、酶聯(lián)免疫吸附法、微柱篩選法和一步式檢測(cè)金標(biāo)試紙法)等檢測(cè)手段[6]，國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中也有相關(guān)測(cè)定方法規(guī)定，但對(duì)多種霉菌毒素的同時(shí)測(cè)定尚沒有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法。國外報(bào)道Veronica Maria Teresa Lattanzio等[7]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)玉米中多種霉菌毒素及其代謝產(chǎn)物同時(shí)檢測(cè)，但提取凈化手段繁瑣或效果不佳，基質(zhì)單一，不適合于開展日常的檢測(cè)。筆者利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)花生及其制品中多種霉菌毒素同時(shí)測(cè)定，以PBS溶液和甲醇-水溶液提取，經(jīng)免疫親和柱凈化的手段，有效地降低了花生本底干擾，提高了檢測(cè)靈敏度，可滿足殘留檢測(cè)和目前國外檢測(cè)限量(MRL)的需要，提高了目前花生及其制品中多種霉菌毒素殘留的檢測(cè)能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

甲醇、乙腈、甲苯、乙酸：色譜級(jí)，德國Merck公司；

PBS溶液：北京中檢維康技術(shù)有限公司；

霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sulpco公司和美國Vicam公司；

免疫親和柱：Myco6in1TMLC／MS／MS型，美國VICAM公司；

液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜儀：ACQUITY TQ Detector，配有電噴霧離子源(ESI)，美國 Waters公司；

電子天平：PB-203E型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

恒溫氮吹裝置：N-EVAP14165型，美 國Organomation聯(lián)合公司。

1.2 液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLC反 相C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；離子化模式：電噴霧電離正離子模式(ESI+)和電噴霧電離負(fù)離子模式(ESI-)，一次進(jìn)樣；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；其它質(zhì)譜條件：見表1；流動(dòng)相：乙腈和10 mmol／L乙酸銨溶液梯度洗脫，見表2,流速為0.4 mL／min ；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3 樣品預(yù)處理

樣品經(jīng)花生粉碎機(jī)粉碎成均勻的試樣。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法(MRM)測(cè)定的質(zhì)譜條件參數(shù)

表2 梯度洗脫程序

1.3.1 提取

稱取5 g試樣(精確到0.01 g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加入PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后以4000 r／min離心10 min。取上層17.5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加入17.5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后以4000 r／min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液B)。

1.3.2 免疫親和柱凈化和洗脫

將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下，準(zhǔn)確移取50 mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20 mL PBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；準(zhǔn)確移取5 mL提取液A以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20 mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經(jīng)親和柱，棄去全部流出液。將1.5 mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當(dāng)甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜置5 min，再將1.5 mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中。

1.3.3 定容

將上述收集于玻璃試管中的洗脫液在50℃下氮?dú)獯蹈?，加?.5 mL體積比為1∶1的水-乙腈溶液(相當(dāng)于1 g樣品)，充分渦旋混合后，過0.22 μm有機(jī)濾膜，用液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取過程

在優(yōu)化提取試驗(yàn)過程中，采用回收試驗(yàn)比較了單個(gè)提取[用PBS溶液或70%甲醇-水(體積比為7∶3)溶液]和雙重提取[先用PBS溶液提取，再用70%甲醇-水(體積比為7∶3)溶液提取，合并兩份提取液]的效果，表明雙重提取更為充分徹底，能得到較高的回收率，尤其是伏馬毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，需要雙重提取來完善提取過程。

2.2 凈化和洗脫過程

實(shí)驗(yàn)所用Myco6in1TMLC／MS／MS免疫親和柱[8]的優(yōu)點(diǎn)是具有高度的特異性，使用時(shí)不需要活化，但是上樣時(shí)有機(jī)溶劑的含量應(yīng)嚴(yán)格控制，甲醇和乙腈等有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)不能超過20%，否則會(huì)影響毒素的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。

雖然免疫親和柱具有選擇性吸附的特性，但是樣品基質(zhì)中，某些具有生物活性的雜質(zhì)也會(huì)有少量吸附，為了消除這些雜質(zhì)，實(shí)驗(yàn)選擇用真菌毒素緩沖液來淋洗，一可以去雜質(zhì)，二可以痊愈脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇親水性較強(qiáng))[9]，對(duì)復(fù)雜的樣品基質(zhì)能達(dá)到非常好的凈化效果，而單純用純水淋洗，雜質(zhì)的去除效果不好，易干擾測(cè)定。

將1.5 mL甲醇以1滴／秒的流速淋洗親和柱，收集淋洗液時(shí)當(dāng)大部分甲醇過柱(不要完全過柱)后，停止加壓，靜置5 min，以確保洗脫完全；再用1.5 mL甲醇以1滴／秒的流速淋洗親和柱，收集全部淋洗液，此次確保洗脫徹底。

在對(duì)樣品凈化過程研究中發(fā)現(xiàn)，由于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇親水性強(qiáng)，過柱的PBS溶液中含甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溶液的體積對(duì)它的回收有較大的影響，因此在70%甲醇-水(體積比為7∶3)提取液過柱后和PBS提取液過柱前要用PBS溶液20 mL淋洗柱子，以痊愈脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。

2.3 儀器條件

根據(jù)固定相的適用范圍和擬分析霉菌毒素的結(jié)構(gòu)特性，采用ACQUITY UPLC反相C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)，進(jìn)行樣品分析，柱效高，分離效果好。

由于采用電噴霧(ESI)模式，為了利于去溶劑化，選擇乙腈為流動(dòng)相中的有機(jī)相；為改善色譜分離效果，提高質(zhì)譜響應(yīng)，向流動(dòng)相的水相中添加乙酸和乙酸銨，最佳配比為0.1%乙酸(體積比)和10 mmol／L乙酸銨。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，以信噪比(S／N)為10時(shí)的檢測(cè)濃度作為檢出限，用含0.5%甲酸(體積比)和10 mmol／L乙酸銨的水溶液將配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1，2，5，10，20倍檢出限的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測(cè)定，以峰面積y(縱坐標(biāo))對(duì)相應(yīng)霉菌毒素的濃度x(橫坐標(biāo))作圖，結(jié)果表明，待測(cè)化合物濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程、線性范圍及檢出限見表3。

表3 方法的檢出限和線性方程、線性范圍

2.5 方法的回收率與精密度

本方法的室內(nèi)回收率和精密度試驗(yàn)，以不含以上各霉菌毒素的花生為空白樣品基質(zhì)，進(jìn)行1倍檢出限濃度水平的添加回收試驗(yàn)，平行測(cè)定10次，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法平均回收率為72.35%～97.82%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.95%～18.41%。表4中回收率與精密度數(shù)據(jù)符合國家規(guī)定殘留分析對(duì)準(zhǔn)確度與精密度的要求，說明本方法具有較好的可靠性與可行性。

表4 樣品中添加霉菌毒素的回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4

空白樣品譜圖及檢出限添加水平的黃曲霉毒素B2譜圖分別見圖1、圖2。

3 結(jié)語

采用多種霉菌毒素免疫親和柱凈化的以LC／ESI-MS／MS方式同時(shí)測(cè)定花生及其制品中黃曲霉毒素(B1，B2，G1，G2)、赭曲霉毒素 A、伏馬毒素 B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素和玉米赤霉烯酮。方法所涉及的相關(guān)霉菌毒素的測(cè)試水平的回收率和重現(xiàn)性等技術(shù)指標(biāo)均符合國內(nèi)外相關(guān)要求；該方法的檢出限滿足國內(nèi)、國際對(duì)上述霉菌毒素已規(guī)定或正在制定的最大允許水平要求，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

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