UPLC–MS–MS法測(cè)定血液中5種吩噻嗪類藥物

趙蒙，王朝虹，劉勇，呂俊崗

(最高人民檢察院檢察技術(shù)信息中心，北京 100040)

吩噻嗪及其衍生品一般稱為吩噻嗪類，它能抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有安眠鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用，被廣泛用作治療精神病藥物，抑制由于藥物、癌癥等引起的嘔吐，也用于增強(qiáng)麻醉、催眠、鎮(zhèn)痛的效能。然而吩噻嗪類藥物吸收迅速且易在體內(nèi)代謝和分解，體液中藥物的原型含量很低，特別是在服藥18 h后，分布在體內(nèi)的原藥甚少[1]。因此，此類藥物分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確度尤為重要。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)體內(nèi)吩噻嗪藥物的檢驗(yàn)方法有固相萃取 – 氣相色譜法[1]、超高效液相色譜法[2–4]等，但這些方法存在靈敏度低、樣品檢驗(yàn)過程復(fù)雜、分析時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性結(jié)果還需驗(yàn)證等問題。近年來(lái)，液質(zhì)聯(lián)用法已成為檢測(cè)各類藥物的主要方法，特別是液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法，由于其良好的適用性、定性定量功能及高靈敏度，而被廣泛應(yīng)用于司法鑒定、臨床等領(lǐng)域中。筆者建立了血液中5種常見吩噻嗪藥物的分析方法，該法快速、穩(wěn)定、前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高，可有效地應(yīng)用于法醫(yī)毒物和臨床檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：TQ–S型，美國(guó)沃特世公司；

離心機(jī)：Blofuge Primo型號(hào)，美國(guó)Thermo公司；

震蕩器：CUTE MIXER CM–1000型，日本EYELA公司；

甲酸：HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司；

空白血：紅十字會(huì)血站；

甲醇、乙腈：LC–MS級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司；

固相萃取柱：Waters Oasis HLB，30 μm，1 mL／20 mg，美國(guó)沃特世公司；

去磷脂板：Ostro 96孔磷脂去除板，美國(guó)沃特世公司；

正壓提取裝置：Positive Prssure–96型，美國(guó)沃特世公司；

異丙嗪、泰爾登、氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪5種吩噻嗪類標(biāo)準(zhǔn)樣品：1 mg／mL的甲醇溶液，北京百靈威科技有限公司；

實(shí)驗(yàn)用水為Millipore milli–Q Integal 3型高純水機(jī)制。

1.2 液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜條件

(1)色譜條件

色譜柱：ACQULTY UPLC HSS SB C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國(guó)waters公司)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；柱溫：35℃；流速：0.5 μL／min ；進(jìn)樣量：5 μL ；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

(2)質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；毛細(xì)管電壓：0.5 kV；去溶劑氣溫度：500℃；去溶劑氣流速：800 L／h；碰撞氣流速：0.16 mL／min；5種吩噻嗪類藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表2

1.3 樣本提取方法

取1 mL血樣，加入3 mL 2%甲酸乙腈溶液(4℃冷藏)，渦旋震蕩10 min，離心10 min兩次(8000 r／min)，取上清液裝瓶，待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件

用儀器IntelliStart功能，通過蠕動(dòng)泵將濃度為100 ng／mL的5種吩噻嗪標(biāo)準(zhǔn)液以流速20 μg／mL注射到ESI離子源中。在正離子檢測(cè)模式下對(duì)5種藥物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜母離子(m／z)分析，得到了準(zhǔn)分子離子峰(M+1)；對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜子離子(m／z)分析，自動(dòng)得到離子碎片信息；選擇基線噪音低、響應(yīng)值高的離子對(duì)作為監(jiān)測(cè)離子對(duì)；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集數(shù)據(jù)，并優(yōu)化各離子對(duì)的錐孔電壓 Cone(V)、碰撞能電壓 Collision(eV)、毛細(xì)管電壓Capillary(kV)及去溶劑氣流速、溫度等，確定了1.2(2)的質(zhì)譜條件。色譜圖見圖1。

表2 5種吩噻嗪類藥物的MS–MS參數(shù)

2.2 流動(dòng)相

分別選用3種流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液、2%氨水水溶液及pH 10的5 mmol／L碳酸氫銨水溶液，用HSS柱分析5種吩噻嗪類藥物，比較其響應(yīng)值，圖2為不同流動(dòng)相及柱子對(duì)吩噻嗪類藥物的響應(yīng)變化。由圖2可知，選用流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液通過HSS柱分析后5種吩噻嗪類藥物的響應(yīng)較高，且無(wú)干擾，因此采用0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。

2.3 樣本前處理、基質(zhì)效應(yīng)、添加回收率的考察

分別選用過HLB小柱固相萃取、酸化乙腈沉淀蛋白及利用Ostros 96孔板去除磷脂法3種不同的前處理方法，通過提取前、后添加法，按照文獻(xiàn)[5]中所述，比較標(biāo)準(zhǔn)品溶液的信號(hào)峰面積(Set1)、不同來(lái)源基質(zhì)提取后加標(biāo)的信號(hào)峰面積(Set2)及基質(zhì)提取前加標(biāo)的信號(hào)峰面積(Set3)。基質(zhì)效應(yīng)=Set2／Set1；加標(biāo)回收率=Set3／Set2。這種考察方法可量化評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)也考察方法的提取回收效率。分別考察高、中、低(0.02，2，20 ng／mL)3個(gè)濃度級(jí)別、平行6組操作，試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，經(jīng)酸化乙腈沉淀蛋白提取后的樣本提取回收率高、基質(zhì)效應(yīng)小，且此提取方法操作簡(jiǎn)單、成本低、穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，因此選用酸化乙腈沉淀蛋白提取樣品。

表3 3種不同前處理方法的比較

2.4 線性方程及檢出限

在空白血樣中添加不同濃度的5種吩噻嗪類的對(duì)照品溶液，濃度分別為 0.01，0.02，0.05，0.2，2，20 ng／mL的血液樣品，血樣中5種吩噻嗪類藥物的質(zhì)量濃度x在0.05～20 ng／mL濃度范圍內(nèi)與峰面積y呈良好的線性關(guān)系。異丙嗪、泰爾登、氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪的檢出限分別為0.02，0.01，0.01，0.01，0.01 ng／mL。血液中5種吩噻嗪類藥物的線性范圍，線性方程，相關(guān)系數(shù)，檢出限見表4。

2.5 精密度試驗(yàn)

在空白血樣中添加不同量的5種吩噻嗪類的混合對(duì)照品，得到一系列濃度為0.02，2，20 ng／mL的血液樣品，每個(gè)濃度點(diǎn)做6個(gè)平行樣本進(jìn)行操作，每天監(jiān)測(cè)10次，連續(xù)測(cè)定3 d，用峰面積計(jì)算日內(nèi)、日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表5。

表4 血液中5種吩噻嗪類藥物的線性范圍、線性方程、檢出限

表5 血液中5種吩噻嗪藥物方法的日內(nèi)、日間精密度

由表5可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%，說明本方法的精密度較高。

3 結(jié)語(yǔ)

采用UPLC–MS–MS法同時(shí)檢測(cè)血液中5種吩噻嗪類藥物，該法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、基質(zhì)效應(yīng)低、準(zhǔn)確可靠，適用于臨床和法醫(yī)毒物中的檢測(cè)鑒定。

[1]王芳林，劉耀，封世珍，等.生物體內(nèi)吩噻嗪藥物的分析[C]//第五次全國(guó)法醫(yī)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集.北京，1996: 333–335.

[2]Maria Addolorata Saracino，Mario Amoreb，Elena Baioni.Determination of selected phenothiazines in human plasma by solid-phase extraction and liquid chromatography with coulometric detection[J]. Analytica Chimica Acta，2008，624: 308–316.

[3]Garratt W Ponder，Sandra L Butram，Amanda Adams.Resolution of promethazine，ethopropazine，trimeprazine and trimipramine enantiomers on selected chiral stationary phases using high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A，1995，692: 173–182.

[4]Einosuke Tanaka，Takako Nakamura，asaru Terada，et al. Simple and simultaneous determination for 12 phenothiazines in human serum by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography B，2007，854: 116–120.

[5]Matuszewski B K，Constanzer M L，Chavez-Eng C M.Strategiesfor the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC–MS／MS [J]. Anal Chem，2003，75: 3019–3030.