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    Pax-8基因抑制后心肌細(xì)胞中UCP2的表達(dá)

    2012-08-21 06:41:06戴曉春黃曉燕周希高瞻王本極張艷麗楊德業(yè)
    關(guān)鍵詞:純合子室間隔心肌細(xì)胞

    戴曉春,黃曉燕,周希,高瞻,王本極,張艷麗,楊德業(yè)

    (溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科,溫州醫(yī)學(xué)院心血管生物和基因研究所,浙江 溫州 325000)

    室間隔缺損(ventricular septum defect,VSD)是常見(jiàn)的先天性心臟病,楊德業(yè)教授的研究組已證實(shí)Pax-8與下游基因NR4A1是和VSD生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因,Pax-8基因被系統(tǒng)敲除后,顯示左心室肌和室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重,同時(shí)伴有線粒體體積減少,數(shù)量增多[1-2]。大多數(shù)的研究顯示,線粒體在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起了重要作用,特別是線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白 2(uncoupling protein 2,UCP2)。UCP2具有質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,引起線粒體質(zhì)子漏,使氧化磷酸化解偶聯(lián),調(diào)控線粒體合成ATP,抑制線粒體內(nèi)活性氧族(ROS)[3]。ROS參與了凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同階段[4]。上述研究提示UCP2是一個(gè)重要的凋亡調(diào)節(jié)基因。本實(shí)驗(yàn)觀察Pax-8基因抑制后心肌細(xì)胞中UCP2的變化,探討UCP2在心肌細(xì)胞凋亡中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物:Pax-8基因敲除的純合子小鼠(Pax-8 KO-/-)、Pax-8基因敲除的雜合子小鼠(Pax-8 KO+/-)和野生型小鼠(Pax-8 KO+/+)各10只。(Pax-8 KO+/-)小鼠由德國(guó)Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠贈(zèng)。

    1.1.2 細(xì)胞:H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù),置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃,5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

    1.1.3 試劑:Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒1、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,小鼠抗大鼠Pax-8抗體、小鼠抗大鼠UCP2抗體、兔抗小鼠IgG抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,小鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自上??党缮锕こ逃邢薰?,ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cell Signal 公司,RT試劑盒購(gòu)自加拿大MBI Fermentas公司,PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司,PMSF RIPA BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇海門碧云天試劑公司,線粒體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司,其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR鑒定小鼠基因型:剪取小鼠尾尖0.5~1 cm,消化小鼠尾巴,提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物為5’-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3’,5’-GC TAAGAGAA-GGTGGATGAGAG-3’,5’-GATGCTGCCAGTCTC GTAG-3’,目的基因片斷長(zhǎng)度分別為370 bp和390 bp。PCR采用20μL體系,其中含有DNA 0.8μL,10×緩沖液2μL,特異性引物各0.8μL,Taq DNA聚合酶0.15μL,dd H2O 11.45μL;反應(yīng)條件:94 ℃5 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,94℃ 15 s,57 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,25個(gè)循環(huán),72℃ 5 min,每組取6μL PCR產(chǎn)物用含Gold View的15%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析系統(tǒng)(Quantity One)攝像分析。

    1.2.2 Pax-8 siRNA的表達(dá)效率:轉(zhuǎn)染后48 h,Trizol試劑裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA。Pax-8 siRNA組、NC siRNA組和空白對(duì)照組均各取3μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取各組反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別行PCR,擴(kuò)增Pax-8和GAPDH片段。Pax-8上游引物為5’-CGGCAA CGCATTGTGGA-3’,下游引物為5’-GTCCTGGGCTCA GAGATTTGG-3’,產(chǎn)物210 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照,GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游引物為5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’,產(chǎn)物123 bp。Pax-8反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min后,94℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min。GAPDH反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min后,94 ℃ 30 s,54.6 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min每組取10μL PCR產(chǎn)物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。Western blot法檢測(cè)Pax-8蛋白表達(dá)水平,轉(zhuǎn)染后24 h,裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì),BCA法測(cè)定蛋白濃度,各組上樣50μg,行10% SDSPAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,7.5%脫脂牛奶封閉2.5 h。小鼠抗大鼠Pax-8抗體(1:100)4 ℃孵育過(guò)夜,TBST溶液洗膜3次,每次10 min。室溫下加入兔抗小鼠IgG抗體(1:2000)孵育1.5 h,洗膜3次。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,X線片曝光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化Pax-8蛋白質(zhì)表達(dá)。用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

    1.2.3 UCP2在Pax-8抑制后心肌細(xì)胞中的表達(dá):RTPCR法檢測(cè)UCP2表達(dá)水平。提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,UCP2上游引物為5’-CGACAAC CACCCAATGAAT-3’,下游引物為5’-GAGTGCCCTCAG CGAAGTC-3’,產(chǎn)物大小為324 bp;GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游引物為5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’,產(chǎn)物大小為123 bp。管家基因GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化UCP2 mRNA表達(dá)。UCP2反應(yīng)條件如下:94 ℃ 5 min后,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min。GAPDH反應(yīng)條件如下:94 ℃變性5 min后, 94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,28個(gè)循環(huán)后72 ℃ 10 min,每組取6μL PCR產(chǎn)物用含Gold View的15%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析系統(tǒng)(Quantity One)攝像分析。Western blot法檢測(cè)UCP2蛋白表達(dá)水平。取小鼠心臟組織(或心肌細(xì)胞),線粒體試劑盒提取線粒體,裂解線粒體提取線粒體的蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,各組上樣100μg,進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2.5 h。小鼠抗大鼠UCP2 抗體(1:400)孵育過(guò)夜,TBST溶液洗膜3次,每次10 min。室溫下加入兔抗小鼠IgG抗體(1:5000)孵育1.5 h,洗膜3次,10 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,X線片曝光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化UCP2蛋白質(zhì)表達(dá),Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 16.0軟件完成統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,獨(dú)立的兩組間比較用SNK-q檢驗(yàn)和t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR鑒定小鼠基因型 雌的(Pax-8 KO+/-)和雄的(Pax-8 KO+/-)交配可獲得Pax-8 KO-/-(純合子)和Pax-8 KO+/-(雜合子),小鼠出現(xiàn)一條370 bp左右條帶為Pax-8基因敲除小鼠純合子(Pax-8 KO-/-),370 bp和390 bp左右條帶為Pax-8基因敲除小鼠雜合子(Pax-8 KO+/-),390 bp左右條帶為野生型(Pax-8 KO+/+),如圖1。

    圖1 小鼠基因型鑒定

    2.2 RT-PCR檢測(cè)Pax-8 siRNA的表達(dá)效率 與NC siRNA組(mRNA為0.69±0.15,蛋白為0.75±0.10)相比,Pax-8 siRNA組Pax-8 mRNA(0.26±0.11)表達(dá)下調(diào)62.31%(P<0.05),蛋白(0.34±0.06)表達(dá)下調(diào)54.67%(P<0.05)。與空白對(duì)照組(mRNA為0.72±0.23,蛋白為0.84±0.19)比較,Pax-8siRNA組Pax-8的mRNA表達(dá)下調(diào)63.89%(P<0.05),蛋白表達(dá)下調(diào)59.52%(P<0.05)。NC siRNA組與空白對(duì)照組的Pax-8 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如圖2。

    2.3 Pax-8敲除小鼠UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)與Pax-8基因敲除小鼠雜合子(Pax-8 KO+/-)組(mRNA為0.85±0.23,蛋白為0.86±0.14)相比,Pax-8基因敲除小鼠純合子(Pax-8 KO-/-)組UCP2的mRNA(1.29±0.25)的表達(dá)上調(diào)34.11%(P<0.05),蛋白(1.26±0.13)的表達(dá)上調(diào)31.75%(P<0.05),與野生型(Pax-8 KO+/+)組UCP2(mRNA為0.84±0.23,蛋白為0.80±0.17)相比,實(shí)驗(yàn)組Pax-8基因敲除小鼠純合子(Pax-8 KO-/-)組UCP2的mRNA表達(dá)上調(diào)34.88%(P<0.05),蛋白表達(dá)上調(diào)36.50%(P<0.05),而對(duì)照組之間,Pax-8基因敲除小鼠雜合(Pax-8 KO+/-)組和野生型(Pax-8 KO+/+)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如圖3。

    圖2 Pax-8 siRNA的表達(dá)效率檢測(cè)

    圖3 Pax-8敲除小鼠UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá)

    2.4 Pax-8 siRNA組的UCP2表達(dá)上調(diào) 與NC siRNA組的UCP2(mRNA為0.78±14,蛋白為0.77±0.19)相比,Pax-8 siRNA組UCP2(mRNA為1.07±0.08)的表達(dá)上調(diào)27.10%(P<0.05),蛋白表達(dá)(1.02±0.20)上調(diào)24.50%(P<0.05)。與空白對(duì)照組的UCP2(mRNA為0.77±0.1,蛋白為0.75±0.13)比較,Pax-8 siRNA組UCP2的mRNA表達(dá)上調(diào)28.03%(P<0.05),蛋白質(zhì)上調(diào)26.47%(P<0.05)。NC siRNA組與空白對(duì)照組的UCP2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如圖4。

    圖4 Pax-8基因干擾后UCP2在大鼠心肌中的表達(dá)

    3 討論

    解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein,UCP2)屬于線粒體陰離子載體家族成員,基因位于小鼠的第7條染色體、人的第11條染色體上[5]。它是一種介導(dǎo)線粒體質(zhì)子漏的蛋白,降低線粒體在呼吸時(shí)形成的H+梯度,使氧化磷酸化解偶聯(lián),ATP合成降低,以及膜電位下降[6]。UCP2 mRNA廣泛存在于骨骼肌、心肌、胎盤、肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、肺、胃、和小腸等組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[7],然而UCP2蛋白僅在少數(shù)組織中表達(dá),包括胰腺、胃、脾、心、腦和肺中[8]。目前研究表明UCP2可以調(diào)節(jié)胰島素的分泌[9]、Ca2+超載、ROS[10]的生成,以及調(diào)節(jié)ATP的合成[11]。然而,關(guān)于UCP2蛋白的生理功能仍然存在許多爭(zhēng)論,越來(lái)越多的研究表明UCP2在不同組織中可能發(fā)揮不同的生理功能。在不同類型細(xì)胞中,UCP2過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致不同繼發(fā)效應(yīng),如在成纖維細(xì)胞中,UCP2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及存活無(wú)影響,但在HeLa細(xì)胞中UCP2過(guò)表達(dá)卻能夠降低線粒體跨膜電壓并促進(jìn)細(xì)胞死亡[12]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示,與Pax-8基因敲除雜合子和野生型小鼠心肌細(xì)胞相比,Pax-8基因敲除純合子小鼠心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯上調(diào);同時(shí),與NC siRNA組和空白對(duì)照組相比,Pax-8 siRNA組UCP2的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào),而Pax-8基因抑制后的心肌細(xì)胞凋亡明顯增加[2,13]。Pax-8基因敲除的純合子小鼠心臟研究結(jié)果顯示心臟成球形,左心室壁肥厚,室間隔增厚,左心室乳頭肌肥大。病理學(xué)顯示左心室肌和室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重, 同時(shí)伴有線粒體體積減少,數(shù)量增多。Pax-8基因敲除的純合子小鼠在出生后即表現(xiàn)出心室重構(gòu)[2]。左室重構(gòu)時(shí),心肌單位橫截面上毛細(xì)血管密度降低,導(dǎo)致心肌相對(duì)供血不足,處于相對(duì)能量缺乏和低氧狀態(tài),心肌細(xì)胞ROS增多,導(dǎo)致線粒體溶解,甚至心肌細(xì)胞凋亡[14-15]。Maron等[16]指出,心肌肥大早期,線粒體體積代償性增加,但是在晚期,其體積則縮小,此為肥大心肌趨于衰竭的形態(tài)特征, 心肌細(xì)胞中線粒體的機(jī)能主要和有氧代謝產(chǎn)生化學(xué)能有關(guān),故其所占心肌細(xì)胞的容積與能量利用有關(guān)。我們認(rèn)為可能的機(jī)制為:Pax-8基因抑制后,心室進(jìn)行重構(gòu),在室間隔心室重構(gòu)中,心肌細(xì)胞的肥大和纖維化增加,使單位橫截面上的心肌細(xì)胞數(shù)量減少,而單位橫截面上的UCP2仍然保持較高水平,說(shuō)明單個(gè)心肌細(xì)胞中UCP2含量上升。心室重構(gòu)導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS增多[17],此時(shí),UCP2增加雖然能拮抗ROS的增長(zhǎng)[18],延緩纖維化、室間隔心室重構(gòu)的進(jìn)程,減少細(xì)胞的凋亡,但同時(shí)使心肌細(xì)胞ATP產(chǎn)生的障礙加重,使細(xì)胞凋亡。

    綜上所述,我們推測(cè)Pax-8基因抑制后,UCP2基因的表達(dá)上調(diào),室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重。然而UCP2是一個(gè)雙向因素,如果能在保證心臟能量供給充足的情況下,同時(shí)對(duì)UCP2基因進(jìn)行干預(yù),可能會(huì)減少室間隔細(xì)胞的凋亡,但是其具體機(jī)制還未明確,有待進(jìn)一步研究。

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