• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Pax-8基因抑制后心肌細(xì)胞中UCP2的表達(dá)

    2012-08-21 06:41:06戴曉春黃曉燕周希高瞻王本極張艷麗楊德業(yè)
    關(guān)鍵詞:純合子室間隔心肌細(xì)胞

    戴曉春,黃曉燕,周希,高瞻,王本極,張艷麗,楊德業(yè)

    (溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科,溫州醫(yī)學(xué)院心血管生物和基因研究所,浙江 溫州 325000)

    室間隔缺損(ventricular septum defect,VSD)是常見(jiàn)的先天性心臟病,楊德業(yè)教授的研究組已證實(shí)Pax-8與下游基因NR4A1是和VSD生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因,Pax-8基因被系統(tǒng)敲除后,顯示左心室肌和室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重,同時(shí)伴有線粒體體積減少,數(shù)量增多[1-2]。大多數(shù)的研究顯示,線粒體在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起了重要作用,特別是線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白 2(uncoupling protein 2,UCP2)。UCP2具有質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,引起線粒體質(zhì)子漏,使氧化磷酸化解偶聯(lián),調(diào)控線粒體合成ATP,抑制線粒體內(nèi)活性氧族(ROS)[3]。ROS參與了凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同階段[4]。上述研究提示UCP2是一個(gè)重要的凋亡調(diào)節(jié)基因。本實(shí)驗(yàn)觀察Pax-8基因抑制后心肌細(xì)胞中UCP2的變化,探討UCP2在心肌細(xì)胞凋亡中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物:Pax-8基因敲除的純合子小鼠(Pax-8 KO-/-)、Pax-8基因敲除的雜合子小鼠(Pax-8 KO+/-)和野生型小鼠(Pax-8 KO+/+)各10只。(Pax-8 KO+/-)小鼠由德國(guó)Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠贈(zèng)。

    1.1.2 細(xì)胞:H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù),置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃,5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

    1.1.3 試劑:Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒1、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,小鼠抗大鼠Pax-8抗體、小鼠抗大鼠UCP2抗體、兔抗小鼠IgG抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,小鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自上??党缮锕こ逃邢薰?,ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cell Signal 公司,RT試劑盒購(gòu)自加拿大MBI Fermentas公司,PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司,PMSF RIPA BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇海門碧云天試劑公司,線粒體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司,其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR鑒定小鼠基因型:剪取小鼠尾尖0.5~1 cm,消化小鼠尾巴,提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物為5’-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3’,5’-GC TAAGAGAA-GGTGGATGAGAG-3’,5’-GATGCTGCCAGTCTC GTAG-3’,目的基因片斷長(zhǎng)度分別為370 bp和390 bp。PCR采用20μL體系,其中含有DNA 0.8μL,10×緩沖液2μL,特異性引物各0.8μL,Taq DNA聚合酶0.15μL,dd H2O 11.45μL;反應(yīng)條件:94 ℃5 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,94℃ 15 s,57 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,25個(gè)循環(huán),72℃ 5 min,每組取6μL PCR產(chǎn)物用含Gold View的15%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析系統(tǒng)(Quantity One)攝像分析。

    1.2.2 Pax-8 siRNA的表達(dá)效率:轉(zhuǎn)染后48 h,Trizol試劑裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA。Pax-8 siRNA組、NC siRNA組和空白對(duì)照組均各取3μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取各組反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別行PCR,擴(kuò)增Pax-8和GAPDH片段。Pax-8上游引物為5’-CGGCAA CGCATTGTGGA-3’,下游引物為5’-GTCCTGGGCTCA GAGATTTGG-3’,產(chǎn)物210 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照,GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游引物為5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’,產(chǎn)物123 bp。Pax-8反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min后,94℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min。GAPDH反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min后,94 ℃ 30 s,54.6 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min每組取10μL PCR產(chǎn)物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。Western blot法檢測(cè)Pax-8蛋白表達(dá)水平,轉(zhuǎn)染后24 h,裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì),BCA法測(cè)定蛋白濃度,各組上樣50μg,行10% SDSPAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,7.5%脫脂牛奶封閉2.5 h。小鼠抗大鼠Pax-8抗體(1:100)4 ℃孵育過(guò)夜,TBST溶液洗膜3次,每次10 min。室溫下加入兔抗小鼠IgG抗體(1:2000)孵育1.5 h,洗膜3次。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,X線片曝光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化Pax-8蛋白質(zhì)表達(dá)。用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

    1.2.3 UCP2在Pax-8抑制后心肌細(xì)胞中的表達(dá):RTPCR法檢測(cè)UCP2表達(dá)水平。提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,UCP2上游引物為5’-CGACAAC CACCCAATGAAT-3’,下游引物為5’-GAGTGCCCTCAG CGAAGTC-3’,產(chǎn)物大小為324 bp;GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游引物為5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’,產(chǎn)物大小為123 bp。管家基因GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化UCP2 mRNA表達(dá)。UCP2反應(yīng)條件如下:94 ℃ 5 min后,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min。GAPDH反應(yīng)條件如下:94 ℃變性5 min后, 94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,28個(gè)循環(huán)后72 ℃ 10 min,每組取6μL PCR產(chǎn)物用含Gold View的15%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析系統(tǒng)(Quantity One)攝像分析。Western blot法檢測(cè)UCP2蛋白表達(dá)水平。取小鼠心臟組織(或心肌細(xì)胞),線粒體試劑盒提取線粒體,裂解線粒體提取線粒體的蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,各組上樣100μg,進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2.5 h。小鼠抗大鼠UCP2 抗體(1:400)孵育過(guò)夜,TBST溶液洗膜3次,每次10 min。室溫下加入兔抗小鼠IgG抗體(1:5000)孵育1.5 h,洗膜3次,10 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,X線片曝光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化UCP2蛋白質(zhì)表達(dá),Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 16.0軟件完成統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,獨(dú)立的兩組間比較用SNK-q檢驗(yàn)和t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR鑒定小鼠基因型 雌的(Pax-8 KO+/-)和雄的(Pax-8 KO+/-)交配可獲得Pax-8 KO-/-(純合子)和Pax-8 KO+/-(雜合子),小鼠出現(xiàn)一條370 bp左右條帶為Pax-8基因敲除小鼠純合子(Pax-8 KO-/-),370 bp和390 bp左右條帶為Pax-8基因敲除小鼠雜合子(Pax-8 KO+/-),390 bp左右條帶為野生型(Pax-8 KO+/+),如圖1。

    圖1 小鼠基因型鑒定

    2.2 RT-PCR檢測(cè)Pax-8 siRNA的表達(dá)效率 與NC siRNA組(mRNA為0.69±0.15,蛋白為0.75±0.10)相比,Pax-8 siRNA組Pax-8 mRNA(0.26±0.11)表達(dá)下調(diào)62.31%(P<0.05),蛋白(0.34±0.06)表達(dá)下調(diào)54.67%(P<0.05)。與空白對(duì)照組(mRNA為0.72±0.23,蛋白為0.84±0.19)比較,Pax-8siRNA組Pax-8的mRNA表達(dá)下調(diào)63.89%(P<0.05),蛋白表達(dá)下調(diào)59.52%(P<0.05)。NC siRNA組與空白對(duì)照組的Pax-8 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如圖2。

    2.3 Pax-8敲除小鼠UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)與Pax-8基因敲除小鼠雜合子(Pax-8 KO+/-)組(mRNA為0.85±0.23,蛋白為0.86±0.14)相比,Pax-8基因敲除小鼠純合子(Pax-8 KO-/-)組UCP2的mRNA(1.29±0.25)的表達(dá)上調(diào)34.11%(P<0.05),蛋白(1.26±0.13)的表達(dá)上調(diào)31.75%(P<0.05),與野生型(Pax-8 KO+/+)組UCP2(mRNA為0.84±0.23,蛋白為0.80±0.17)相比,實(shí)驗(yàn)組Pax-8基因敲除小鼠純合子(Pax-8 KO-/-)組UCP2的mRNA表達(dá)上調(diào)34.88%(P<0.05),蛋白表達(dá)上調(diào)36.50%(P<0.05),而對(duì)照組之間,Pax-8基因敲除小鼠雜合(Pax-8 KO+/-)組和野生型(Pax-8 KO+/+)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如圖3。

    圖2 Pax-8 siRNA的表達(dá)效率檢測(cè)

    圖3 Pax-8敲除小鼠UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá)

    2.4 Pax-8 siRNA組的UCP2表達(dá)上調(diào) 與NC siRNA組的UCP2(mRNA為0.78±14,蛋白為0.77±0.19)相比,Pax-8 siRNA組UCP2(mRNA為1.07±0.08)的表達(dá)上調(diào)27.10%(P<0.05),蛋白表達(dá)(1.02±0.20)上調(diào)24.50%(P<0.05)。與空白對(duì)照組的UCP2(mRNA為0.77±0.1,蛋白為0.75±0.13)比較,Pax-8 siRNA組UCP2的mRNA表達(dá)上調(diào)28.03%(P<0.05),蛋白質(zhì)上調(diào)26.47%(P<0.05)。NC siRNA組與空白對(duì)照組的UCP2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如圖4。

    圖4 Pax-8基因干擾后UCP2在大鼠心肌中的表達(dá)

    3 討論

    解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein,UCP2)屬于線粒體陰離子載體家族成員,基因位于小鼠的第7條染色體、人的第11條染色體上[5]。它是一種介導(dǎo)線粒體質(zhì)子漏的蛋白,降低線粒體在呼吸時(shí)形成的H+梯度,使氧化磷酸化解偶聯(lián),ATP合成降低,以及膜電位下降[6]。UCP2 mRNA廣泛存在于骨骼肌、心肌、胎盤、肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、肺、胃、和小腸等組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[7],然而UCP2蛋白僅在少數(shù)組織中表達(dá),包括胰腺、胃、脾、心、腦和肺中[8]。目前研究表明UCP2可以調(diào)節(jié)胰島素的分泌[9]、Ca2+超載、ROS[10]的生成,以及調(diào)節(jié)ATP的合成[11]。然而,關(guān)于UCP2蛋白的生理功能仍然存在許多爭(zhēng)論,越來(lái)越多的研究表明UCP2在不同組織中可能發(fā)揮不同的生理功能。在不同類型細(xì)胞中,UCP2過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致不同繼發(fā)效應(yīng),如在成纖維細(xì)胞中,UCP2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及存活無(wú)影響,但在HeLa細(xì)胞中UCP2過(guò)表達(dá)卻能夠降低線粒體跨膜電壓并促進(jìn)細(xì)胞死亡[12]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示,與Pax-8基因敲除雜合子和野生型小鼠心肌細(xì)胞相比,Pax-8基因敲除純合子小鼠心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯上調(diào);同時(shí),與NC siRNA組和空白對(duì)照組相比,Pax-8 siRNA組UCP2的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào),而Pax-8基因抑制后的心肌細(xì)胞凋亡明顯增加[2,13]。Pax-8基因敲除的純合子小鼠心臟研究結(jié)果顯示心臟成球形,左心室壁肥厚,室間隔增厚,左心室乳頭肌肥大。病理學(xué)顯示左心室肌和室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重, 同時(shí)伴有線粒體體積減少,數(shù)量增多。Pax-8基因敲除的純合子小鼠在出生后即表現(xiàn)出心室重構(gòu)[2]。左室重構(gòu)時(shí),心肌單位橫截面上毛細(xì)血管密度降低,導(dǎo)致心肌相對(duì)供血不足,處于相對(duì)能量缺乏和低氧狀態(tài),心肌細(xì)胞ROS增多,導(dǎo)致線粒體溶解,甚至心肌細(xì)胞凋亡[14-15]。Maron等[16]指出,心肌肥大早期,線粒體體積代償性增加,但是在晚期,其體積則縮小,此為肥大心肌趨于衰竭的形態(tài)特征, 心肌細(xì)胞中線粒體的機(jī)能主要和有氧代謝產(chǎn)生化學(xué)能有關(guān),故其所占心肌細(xì)胞的容積與能量利用有關(guān)。我們認(rèn)為可能的機(jī)制為:Pax-8基因抑制后,心室進(jìn)行重構(gòu),在室間隔心室重構(gòu)中,心肌細(xì)胞的肥大和纖維化增加,使單位橫截面上的心肌細(xì)胞數(shù)量減少,而單位橫截面上的UCP2仍然保持較高水平,說(shuō)明單個(gè)心肌細(xì)胞中UCP2含量上升。心室重構(gòu)導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS增多[17],此時(shí),UCP2增加雖然能拮抗ROS的增長(zhǎng)[18],延緩纖維化、室間隔心室重構(gòu)的進(jìn)程,減少細(xì)胞的凋亡,但同時(shí)使心肌細(xì)胞ATP產(chǎn)生的障礙加重,使細(xì)胞凋亡。

    綜上所述,我們推測(cè)Pax-8基因抑制后,UCP2基因的表達(dá)上調(diào),室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重。然而UCP2是一個(gè)雙向因素,如果能在保證心臟能量供給充足的情況下,同時(shí)對(duì)UCP2基因進(jìn)行干預(yù),可能會(huì)減少室間隔細(xì)胞的凋亡,但是其具體機(jī)制還未明確,有待進(jìn)一步研究。

    [1] 黃曉燕,高瞻,周希,等.Pax-8基因敲除小鼠心臟中NR4A1基因表達(dá)上調(diào)[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,41(3):205-208.

    [2] 章佳穎,來(lái)丹丹,楊德業(yè),等.Pax-8基因在胚胎心臟發(fā)育中的角色研究[J].中國(guó)病理生理雜志,2009, 25(7):1292 -1297.

    [3] Ricquier D, Bouillaud F.The uncoupling protein homologues:UCP1,UCP2,UCP3,StUCP and AtUCP[J].Biochem J,2000,345(Pt2):161-179.

    [4] Le Bras M,Clement MV,Pervaiz S,et a1.Beaetive oxygen species and the mitochondrial signaling pathway of cell death[J].Histol Histopathol,2005,20(1):205-219.

    [5] Fleury C, Neverova M, Collins S, et al.Uncoupling protein-2: a novel gene linked to besity and hyperinsulinemia[J].Nat Genet,1997,15(3):269-272.

    [6] Gable DR, Stephens JW, Cooper JA, et al. Variation in the UCP2-UCP3 gene cluster predicts the development of type 2 diabetes in healthy middle-aged men[J]. Diabetes,2006,55(5):1504-1511.

    [7] Kim-Han JS,Dugan LL.Mitochondrial uncoupling proteins in the central nervous system[J].Antioxid Redox Signal,2005,7(9-10):1173-1181.

    [8] Chan CB,Harper ME.Uncoupling proteins:role in insulin resistance and insulin insufficiency[J].Curr Diabetes Rev,2006,2(3):271-283.

    [9] Chan CB,Kashemsant N. Regulation of insulin secretion by uncoupling protein [J]. Biochem Soc Trans,2006,34(Pt5):802-805.

    [10] Teshima Y,Akao M,Jones SP,et al. Uncoupling protein-2 overexpression inhibits mitochondrial death pathway in cardiomyocytes[J].Circ Res,2003,93(3):192-200.

    [11] Boss O,Hagen T,Lowell BB.Uncoupling proteins 2 and 3:potential regulators of mitochondrial energy metabolism[J].Diabetes,2000,49(2):143-156.

    [12] Mills EM,Xu D,Fergusson MM,et a1.Regulation of cellular oncosis by uncoupling protein 2[J].J Biol Chem,2002,277(30):27385-27392.

    [13] 高瞻,來(lái)丹丹,張敏,等.Pax-8基因在大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2009,34(9):1082-1084.

    [14] Eghbali M.Cellular origin and distribution of transforming growth factor-beta in the normal rat myocardium[J].Cell Tissue Res,l989,256(3):553-558.

    [15] Tan LB,Jalil JE,Pick R et al.Cardiac myocyte necrosis induced by angiotensin II [J].Circ Res,1991,69(5):l185-1195.

    [16] Maron BJ,Mcintosh CL, Klues HG, et al. Morphologic basis for obstruction to right ventricular outflow in hypertrophic cardiomyopathy [J]. Am J Cardiol, 1993,71(12):1089-1094.

    [17] Van Der Lee KA,Willemsen PH,Van Der Vusse GJ,et a1.Effects of fatty acids on uncoupling protein-2 expression in the rat heart[J].FASEB J,2000,14(3):495-502.

    [18] Negre-Salvayre A,Hirtz C,Carrera G,et a1.A role for uncoupling protein -2 as a regulator of mitochondrial hydrogen peroxide generation[J].FASEB J,1997,1l(10):809-815.

    猜你喜歡
    純合子室間隔心肌細(xì)胞
    HepG2和Huh7細(xì)胞CYP3A4、CYP3A5和PXR基因非編碼單核苷酸多態(tài)性分析
    左歸降糖舒心方對(duì)糖尿病心肌病MKR鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響
    活血解毒方對(duì)缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞凋亡的影響
    急性ST段抬高型心肌梗死合并室間隔穿孔成功救治1例
    肺動(dòng)脈閉鎖合并室間隔缺損不同術(shù)式的療效分析
    心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的研究進(jìn)展
    槲皮素通過(guò)抑制蛋白酶體活性減輕心肌細(xì)胞肥大
    生物教學(xué)中的幾個(gè)誤區(qū)
    考試周刊(2015年53期)2015-09-10 20:42:28
    七氟醚對(duì)小兒室間隔缺損封堵術(shù)中應(yīng)激反應(yīng)的影響
    經(jīng)胸微創(chuàng)封堵術(shù)在治療小兒室間隔缺損中的應(yīng)用
    亚洲av不卡在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 免费高清视频大片| 黄色配什么色好看| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点| av女优亚洲男人天堂| 亚洲,欧美精品.| 一级黄色大片毛片| 国产精品永久免费网站| 日韩欧美精品免费久久 | 一区二区三区高清视频在线| 成人精品一区二区免费| 久久99热6这里只有精品| 午夜福利免费观看在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美色视频一区免费| 亚洲熟妇熟女久久| 国内精品美女久久久久久| 在线国产一区二区在线| 国产亚洲欧美98| 最近中文字幕高清免费大全6 | 成人性生交大片免费视频hd| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 丁香欧美五月| 免费看光身美女| 欧美成人免费av一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲美女视频黄频| 成人免费观看视频高清| a级一级毛片免费在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品熟女少妇av免费看| 18+在线观看网站| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美激情在线99| 久久ye,这里只有精品| 亚洲综合色惰| 欧美区成人在线视频| 免费少妇av软件| 在线免费十八禁| 69人妻影院| 国产视频首页在线观看| www.色视频.com| 亚洲精品,欧美精品| 欧美精品一区二区大全| 网址你懂的国产日韩在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久精品久久久久久久性| 一级毛片我不卡| 18禁在线播放成人免费| 日日撸夜夜添| 国产精品国产三级专区第一集| 人体艺术视频欧美日本| 久久久欧美国产精品| 亚洲人成网站高清观看| 欧美丝袜亚洲另类| 一区二区三区乱码不卡18| av在线播放精品| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲国产av新网站| 亚洲天堂av无毛| 日韩一本色道免费dvd| 国产熟女欧美一区二区| 中文字幕久久专区| 国产欧美日韩精品一区二区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 天天躁日日操中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧美精品专区久久| 欧美区成人在线视频| 久久亚洲国产成人精品v| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久人人爽人人片av| 久久久久九九精品影院| 国产av国产精品国产| 综合色av麻豆| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩av免费高清视频| 国产永久视频网站| 看十八女毛片水多多多| 久热这里只有精品99| 青春草国产在线视频| 免费观看在线日韩| 成人亚洲精品av一区二区| 天堂网av新在线| 亚洲自偷自拍三级| 寂寞人妻少妇视频99o| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲在线观看片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成人二区视频| 99热全是精品| 国内精品宾馆在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲av日韩在线播放| 国产老妇女一区| 国产在线男女| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲国产精品成人久久小说| 大片免费播放器 马上看| 国产精品女同一区二区软件| 大码成人一级视频| 看非洲黑人一级黄片| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品aⅴ在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 99久久精品国产国产毛片| 国产亚洲最大av| 国产一区二区三区av在线| 久久精品人妻少妇| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产av码专区亚洲av| 免费大片黄手机在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 插阴视频在线观看视频| 婷婷色av中文字幕| 秋霞伦理黄片| 国产成人一区二区在线| .国产精品久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲美女视频黄频| 久久人人爽人人爽人人片va| 男女国产视频网站| 最近手机中文字幕大全| 青春草国产在线视频| 欧美97在线视频| 十八禁网站网址无遮挡 | 久久精品国产a三级三级三级| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 街头女战士在线观看网站| 91久久精品国产一区二区成人| 国产大屁股一区二区在线视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩av免费高清视频| 国产精品一二三区在线看| www.av在线官网国产| 亚洲av男天堂| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 欧美区成人在线视频| 麻豆国产97在线/欧美| 色视频www国产| 看免费成人av毛片| 国产成人免费观看mmmm| 女人被狂操c到高潮| 伦理电影大哥的女人| 大码成人一级视频| 国产人妻一区二区三区在| 人妻 亚洲 视频| av播播在线观看一区| 国产免费视频播放在线视频| 久久久欧美国产精品| 视频区图区小说| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 日本欧美国产在线视频| 国产毛片在线视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 秋霞在线观看毛片| 免费观看av网站的网址| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久国产一区二区| 国产乱来视频区| 波野结衣二区三区在线| 国国产精品蜜臀av免费| 中文在线观看免费www的网站| 中文天堂在线官网| 性插视频无遮挡在线免费观看| 成人美女网站在线观看视频| 久久精品国产自在天天线| 老司机影院成人| 高清视频免费观看一区二区| 草草在线视频免费看| 老司机影院成人| 特级一级黄色大片| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久人妻综合| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 国产一级毛片在线| 国产高潮美女av| 综合色丁香网| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 在线观看一区二区三区| 51国产日韩欧美| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久久久午夜电影| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲四区av| 亚洲在久久综合| 日韩大片免费观看网站| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本av手机在线免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲自拍偷在线| 禁无遮挡网站| 黄色配什么色好看| 男女边吃奶边做爰视频| 国产乱人偷精品视频| 男女边摸边吃奶| 一区二区三区免费毛片| 内射极品少妇av片p| xxx大片免费视频| 国产精品久久久久久久久免| 我的老师免费观看完整版| 国产高清有码在线观看视频| 青春草视频在线免费观看| 五月伊人婷婷丁香| 国产黄色视频一区二区在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 搡老乐熟女国产| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品国产三级国产专区5o| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久久精品欧美日韩精品| 又爽又黄a免费视频| 日本与韩国留学比较| 99久国产av精品国产电影| 国产成人freesex在线| 国产成年人精品一区二区| 免费看av在线观看网站| 午夜日本视频在线| 高清欧美精品videossex| 国产伦在线观看视频一区| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一区二区三区免费毛片| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 欧美另类一区| 中文字幕久久专区| 亚州av有码| 超碰97精品在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 国产亚洲精品久久久com| 看免费成人av毛片| 国产综合精华液| 日韩电影二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久精品免费免费高清| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久人人爽人人片av| 天堂中文最新版在线下载 | 波多野结衣巨乳人妻| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日本黄色片子视频| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲综合精品二区| av福利片在线观看| av卡一久久| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲在线观看片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 校园人妻丝袜中文字幕| xxx大片免费视频| 国产在视频线精品| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产一区二区三区av在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 三级经典国产精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产精品99久久久久久久久| 欧美性感艳星| 熟女av电影| 777米奇影视久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 少妇人妻精品综合一区二区| 永久免费av网站大全| 精品久久久久久久末码| 伦理电影大哥的女人| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲无线观看免费| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 联通29元200g的流量卡| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产高清三级在线| 国产成人免费观看mmmm| av黄色大香蕉| 99久久精品热视频| 亚洲精品一区蜜桃| 视频区图区小说| 嘟嘟电影网在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲国产精品成人久久小说| av.在线天堂| 男男h啪啪无遮挡| 国产毛片在线视频| 久久综合国产亚洲精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久热精品热| 久久久久精品性色| av网站免费在线观看视频| 午夜福利视频1000在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 久久ye,这里只有精品| 成人欧美大片| 久久久久久久午夜电影| 另类亚洲欧美激情| 中国国产av一级| 可以在线观看毛片的网站| xxx大片免费视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日本wwww免费看| 极品教师在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产一级毛片在线| eeuss影院久久| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 女人被狂操c到高潮| 只有这里有精品99| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲精品第二区| 中文字幕av成人在线电影| 在线免费十八禁| 在线看a的网站| 日本欧美国产在线视频| 日韩欧美 国产精品| 五月天丁香电影| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| av福利片在线观看| 日本一二三区视频观看| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 1000部很黄的大片| 国产精品一区www在线观看| 在线看a的网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久热精品热| 国产乱来视频区| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 男人舔奶头视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 神马国产精品三级电影在线观看| 成年免费大片在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久久久大尺度免费视频| av免费观看日本| 香蕉精品网在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久久久国产电影| 亚洲美女视频黄频| videos熟女内射| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产一区二区在线观看日韩| av线在线观看网站| 婷婷色综合大香蕉| 韩国av在线不卡| 身体一侧抽搐| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久99热这里只频精品6学生| 麻豆成人av视频| 日本av手机在线免费观看| 日本熟妇午夜| 大片免费播放器 马上看| av天堂中文字幕网| 亚洲精品国产av成人精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 在线看a的网站| 丝袜脚勾引网站| 中文字幕av成人在线电影| 午夜激情福利司机影院| 免费看a级黄色片| 三级国产精品片| 免费看a级黄色片| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲综合色惰| 日韩电影二区| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲va在线va天堂va国产| 波野结衣二区三区在线| 2021少妇久久久久久久久久久| 我的老师免费观看完整版| 黄色视频在线播放观看不卡| 街头女战士在线观看网站| 如何舔出高潮| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲自偷自拍三级| 国产又色又爽无遮挡免| 最近中文字幕高清免费大全6| 女人久久www免费人成看片| 欧美成人a在线观看| 在线天堂最新版资源| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 22中文网久久字幕| 久久久久性生活片| 国产 一区精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩大片免费观看网站| 久热这里只有精品99| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日本熟妇午夜| 亚洲va在线va天堂va国产| 两个人的视频大全免费| 99热这里只有是精品在线观看| av国产免费在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 97超视频在线观看视频| 人人妻人人看人人澡| 舔av片在线| 免费大片黄手机在线观看| 好男人视频免费观看在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲av不卡在线观看| 久久99热这里只有精品18| 禁无遮挡网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产成人福利小说| 一个人看视频在线观看www免费| 六月丁香七月| 国产老妇女一区| 久久久久精品性色| 国产 一区精品| 国产乱人偷精品视频| 一级片'在线观看视频| kizo精华| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美区成人在线视频| 在线免费十八禁| 国产黄频视频在线观看| 伊人久久国产一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人二区视频| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国内精品宾馆在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产69精品久久久久777片| 一区二区av电影网| 成人欧美大片| av在线播放精品| 91狼人影院| 在线观看国产h片| 91狼人影院| 嫩草影院新地址| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久99热这里只有精品18| 青春草视频在线免费观看| 免费大片18禁| 看十八女毛片水多多多| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 街头女战士在线观看网站| 国产在线一区二区三区精| 亚州av有码| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲av日韩在线播放| 久久精品久久久久久久性| 少妇人妻久久综合中文| 赤兔流量卡办理| 丝袜美腿在线中文| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久综合国产亚洲精品| 免费av观看视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 91久久精品电影网| 美女视频免费永久观看网站| 最新中文字幕久久久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 久久久精品免费免费高清| 亚洲,一卡二卡三卡| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 三级国产精品片| 国产精品久久久久久精品电影| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久6这里有精品| 国产午夜福利久久久久久| 国产69精品久久久久777片| av免费在线看不卡| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品国产三级专区第一集| 直男gayav资源| 有码 亚洲区| 大香蕉久久网| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 少妇人妻久久综合中文| 免费看不卡的av| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲av国产av综合av卡| av黄色大香蕉| av在线天堂中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 嫩草影院入口| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产乱人偷精品视频| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美日韩综合久久久久久| 三级国产精品片| 免费电影在线观看免费观看| 国产成人一区二区在线| 国产精品熟女久久久久浪| 免费观看a级毛片全部| 亚洲av成人精品一区久久| 天美传媒精品一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| a级毛色黄片| 各种免费的搞黄视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 婷婷色综合www| 日韩欧美精品v在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜免费鲁丝| 欧美精品一区二区大全| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲最大成人av| 在线a可以看的网站| 久久99热6这里只有精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 欧美人与善性xxx| 五月天丁香电影| 少妇丰满av| 午夜视频国产福利| 性色avwww在线观看| 国产精品无大码| 欧美97在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| freevideosex欧美| 日本一本二区三区精品| 久久97久久精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 成年av动漫网址| 亚洲最大成人av| 免费观看av网站的网址| 婷婷色av中文字幕| 精品久久久久久久久av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 美女高潮的动态| 亚洲av免费在线观看| 久久久久国产网址| 成年人午夜在线观看视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 久久国内精品自在自线图片| 久久精品国产自在天天线| 午夜免费男女啪啪视频观看| 男插女下体视频免费在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲欧美精品专区久久| 免费人成在线观看视频色| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 成人欧美大片| 插阴视频在线观看视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产午夜精品一二区理论片| 最近手机中文字幕大全| 婷婷色综合大香蕉| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| av国产免费在线观看| 另类亚洲欧美激情| 国内精品宾馆在线| 亚洲美女视频黄频| 伦精品一区二区三区| 亚洲成人久久爱视频| 中国三级夫妇交换|