小反芻獸疫病毒H基因在桿狀病毒中的表達

高華峰，信愛國，高 林，楊仕標(biāo)

（云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，昆明 650024）

小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副粘病毒科、麻疹病毒屬的成員，因主要感染小反芻動物而得名，特別是山羊高度易感。國際動物衛(wèi)生組織（OIE）將PPRV感染列為A類疫病，中國也將其列為一類動物疫病。該病主要在非洲及中東地區(qū)流行，近年來在中國周邊國家頻繁發(fā)生，自2007年西藏自治區(qū)首次報道該病疫情以來，現(xiàn)已嚴(yán)重威脅我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。

血凝素蛋白H蛋白是小反芻獸疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白之一，又稱附加蛋白，構(gòu)成病毒的纖突，含609個氨基酸，是最易變異的蛋白，這種高度的變異性可能是免疫壓力選擇的結(jié)果。H蛋白同時具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶的功能，且含有T細胞決定簇，可能與宿主細胞的特異性有關(guān)。H蛋白在病毒與細胞膜結(jié)合過程中作為受體，是引起細胞病變(cytopathic effect, CPE)的決定因素[4]。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸埃希氏菌DH5α、DH10Bac（含Bacmid和Helper）、轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBacHT、小反芻獸疫病毒N75/1弱毒疫苗株及全長cDNA文庫由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存。

1.2 細胞與培養(yǎng)基 昆蟲傳代細胞系Sf9為云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存；Grace's昆蟲培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司。

1.3 酶及試劑 各種工具酶均購自TaKaRa（大連）生物工程工司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購于晶美公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒及凝膠回收試劑盒為上海生工產(chǎn)品；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）為Promega公司產(chǎn)品；組氨酸His單抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自碧云天；引物合成及DNA測序由上海生工完成。

1.4 小反芻獸疫病毒的PCR擴增 根據(jù)小反芻獸疫病毒N75/1毒株序列，合成如下引物用于目的基因的擴增。上游引物的5'端設(shè)計了BamH I酶切位點，在下游引物的5'端設(shè)計了XbaI酶切位點，質(zhì)粒進行PCR擴增：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，共進行18個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。擴增片段膠回收純化后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 序列測定及分析 回收H基因PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體室溫4 h連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂板后14 h培養(yǎng)挑選白色的細胞進行BamH I和XbaI雙酶切鑒定，鑒定出的陽性克隆送上海生要進行序列測定。

1.6 重組表達載體的構(gòu)建 序列測定正確的H雙酶切陽性片段分別與雙酶切的pFastBacHT載體在T4 DNA連接酶作用下16℃連接16 h，構(gòu)建pFastBacHT-H真核表達轉(zhuǎn)移載體，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂板后培養(yǎng)14 h挑選構(gòu)建pFastBacHT-H細胞，進行BamH I和XbaI雙酶切鑒定。鑒定出的陽性克隆提取質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化帶有Bacmid及Helper的DH10Bac感受態(tài)細菌，涂布X-gal及IPTG的篩選平板（含卡那霉素及四環(huán)素抗性），篩選白色菌落進行PCR鑒定，所用的通用引物為Puc/M13。

1.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞 將提取的重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體混勻，加入Grace's細胞培養(yǎng)基（無血清及抗生素）混勻后室溫結(jié)合1 h，共轉(zhuǎn)染生長良好的低代次Sf9細胞，培養(yǎng)8 h后，再取出培養(yǎng)瓶，棄上清后加入含血清和雙抗的Grace's細胞培養(yǎng)基，28℃繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細胞病變。

1.8 SDS-PAGE電泳及Western blot檢測 重組桿狀病毒培養(yǎng)3～4代后，分別收集細胞及血清，進行SDS-PAGE電泳，同時加入同樣處理的昆蟲細胞作為陰性對照。將SDS-PAGE電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，重組蛋白用含5%脫脂乳的TBST封閉4℃過夜，以抗6His標(biāo)鑒蛋白的單抗結(jié)合1 h后，用NBT及BCIP顯色，觀察其特異性條帶。

2 結(jié)果

2.1 小反芻獸疫病毒H基因PCR擴增 小反芻獸疫病毒H基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在1830 bp處出現(xiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 H基因的RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 The RT-PCR amplif i ed results of H gene

2.2 重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建 將小反芻獸疫病毒H基因PCR產(chǎn)物及轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBacHT酶切回收后，經(jīng)連接酶連接后，篩選出重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBacHT-H（圖2）。

2.3 含目的基因的重組Bacmid的篩選與鑒定 將重組質(zhì)粒pFastBacHT-H轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)菌后，在含卡那霉素、四環(huán)素、IPTG和X-gal平板上挑取白色菌落并抽提質(zhì)粒，抽提的質(zhì)粒用PCR鑒定（圖3）。

2.4 重組病毒的細胞病變 將重組桿狀病毒在Sf9細胞上連續(xù)傳代，經(jīng)3代后，H基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達后，昆蟲細胞出現(xiàn)細胞融合、核濃縮等細胞病變（圖4）。

圖2 轉(zhuǎn)移載體的酶切鑒定Fig.2 Identif i cation of pFastBacHT-H

圖3 重組Bacmid的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identif i cation of recombinant plasmid by PCR

圖4 H基因重組桿狀病毒的細胞病變效應(yīng)Fig.4 Cytopathic effect(CPE) of H gene recombinant bacmid

2.5 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot檢測將重組桿狀病毒在Sf9細胞上連續(xù)傳代，經(jīng)3～4代后，收集培養(yǎng)物，將培養(yǎng)物上清及細胞沉淀分別用于SDS-PAGE分析，可見H基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中得到表達，表達產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為46 ku，H蛋白抗6His（祖蛋白）標(biāo)鑒蛋白的單抗進行檢測，可觀察其特異性條帶（圖5）。

3 討論

小反芻獸疫病毒具有紅細胞吸附能力，純化后的病毒能吸附多種動物紅細胞，其吸附能力對雞和猴子的最強，而對人，狗、山羊及綿羊的吸附能力稍差。瞬時表達于細胞表面的重組血凝素蛋白具有凝結(jié)雞紅細胞的生物學(xué)活性，表明該病毒的吸附能力并不依賴于病毒的其他蛋白組分。表達于CV-1細胞的重組血凝素蛋白H還具有神經(jīng)氨酸酶活性，這種活性通過2、3糖苷鍵連接的底物起作用，氮糖基神經(jīng)氨酸和胎球蛋白是兩種廣泛被利用的底物。對小反芻獸疫病疫苗毒株Nig75/1和強毒株Ind/TN87/1 H蛋白分析表明強弱毒株結(jié)合的底物相同，但強毒株Ind/TN87/1 H蛋白對氮糖基神經(jīng)氨酸的結(jié)合能力高于疫苗毒株[5,6]。

圖5 融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot檢測Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of His-H protein

昆蟲細胞表達系統(tǒng)廣泛用于大量生產(chǎn)外源重組蛋白。為表達小反芻獸疫病毒H蛋白，本試驗構(gòu)建了重組桿狀病毒，由于小反芻獸疫病毒H及F蛋白屬于副粘病毒膜整合糖蛋白，H蛋白定位于病毒表面，其免疫原性在表達過程中因融合而增強，重組

病毒及病毒樣粒子在復(fù)制過程中攜帶大量抗原表位，可作為亞單位疫苗的候選蛋白，H起到將病毒粘附于靶細胞表面的功能，協(xié)助F蛋白完成病毒與細胞的融合[7,8]。

小反芻獸疫核蛋白N蛋白的桿狀病毒表達產(chǎn)物作為抗原廣泛用于競爭ELISA試劑中[9]，用于血清學(xué)檢測及疫苗免疫效果分析。本試驗所表達的H蛋白，將用于嘗試作為ELISA的包被抗原，對國內(nèi)小反芻獸疫進行血清學(xué)檢測。

[1] 張喜悅,劉春菊,王志亮,等.小反芻獸疫(PPR)傳入我國的風(fēng)險分析[J].中國動物檢疫, 2007, 24(10): 40-42.

[2] Dhar P, Sreenivasa B P, Barrett T,et al.Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus (PPRV)[J].Vet Microbiol, 2002, 88 (2): 153-159.

[3] Wang Z, Bao J, Wu X,et al.Peste des petits ruminants virus in Tibet, China[J].Emerg Infect Dis, 2009, 15(2):299-301.

[4] Dalan B, Ashley B, Pradyot D,et al.Full genome sequence of peste des petits ruminants virus, a member of the Morbillivirus genus[J].Virus Res, 2005, 110(1-2):119-124.

[5] Shaguna S, Shaila M S.The hemagglutinin-neuraminidase protein of peste des petits ruminants virus is biologically active when transiently expressed in mammalian cells[J].Virus Res, 2001, 75(2): 169-177.

[6] Choppin P W, Scheid A.The role of viral glycoproteins in adsorption, penetration and pathogenicity of viruses[J].Rev Infect Dis, 1980, 2(1): 40-61.

[7] Rahman M M, Shaila M S, Gopinathan K P.Baculovirus diplay of fusion protein of Peste des petits ruminants virus and hemagglutionation protein of Rinderpest virus and immunogenicity of the displayed proteins in mouse model[J].Virology, 2003, 317(1): 36-49.

[8] Yilma T, Hsu D, Jones L,et al.Protection of cattle against rinderpest with vaccinia virus recombinants expressing the HA or F gene[J] Science, 1988, 242(4881): 1058-1061.

[9] Libeau G, Préhaud C, Lancelot R,et al.Development of a competitive ELISA for detecting antibodies to the peste des petits ruminants virus using a recombinant nucleoprotein[J].Res Vet Sci, 1995, 58(1): 50-55.