雞傳染性喉氣管炎病毒（江蘇株）的分離與初步鑒定

趙 妍 ，孔聰聰，張曉敏，崔紅玉 ，石星明 ，蒿蓮薇 ，胡順磊 ，閆 帥 ，薛 美，牛秀杰，李巧玲，王 玫，劉勝旺，王云峰

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，哈爾濱 150001；

2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，昆明 650201)

雞傳染性喉氣管炎（infectious laryngotracheitis,ILT）是由雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。其特征是呼吸困難，咳嗽和咳出血樣滲出物，氣管中上部有黃色干酪樣假膜，剖檢可見喉頭、氣管黏膜腫脹、大面積出血，最終糜爛、壞死[1,2]。自1925年美國的May等首次報道該病以來，ILT在全世界廣泛流行[3]。中國在20世紀50年代末期首次報道該病發(fā)生[4]，90年代開始有更多的報道[5-7]。2009年11月，江蘇省某雞場7周齡種雞突然發(fā)生以呼吸困難為主要特征的疾病，剖檢可見氣管嚴重出血，經(jīng)細菌學檢查未見可疑致病菌，臨床初步診斷為ILT。本研究采集病死雞喉頭氣管組織進行了病毒的分離與鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料與實驗動物 病料采自江蘇某養(yǎng)雞場疑似感染ILT的病雞喉頭氣管組織，9～11日齡SPF雞胚、SPF雞均由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2 主要試劑和儀器 rTaqDNA聚合酶、pMD18-T載體、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；基因組DNA提取試劑盒購自Tiangen公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自BioFlux公司；PCR儀購自Biorad公司；低溫離心機購自Thermo公司。

1.3 病毒分離 將病雞喉頭氣管組織剪碎、研磨，按1:5比例加入PBS溶液，反復凍融3次，離心取上清，加入青霉素-鏈霉素雙抗（終濃度500 U/mL），4℃作用6 h后，以雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM）接種法，將病毒液接種于10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，同時設有陰性對照。逐日觀察，棄去24 h內(nèi)的死胚，連續(xù)觀察5～7 d，及時收獲死胚尿囊液和絨毛尿囊膜，觀察并記錄CAM病變及胚體情況。將收獲的尿囊液和尿囊膜混合，剪碎、研磨，反復凍融3次，離心取上清，以相同方法繼續(xù)傳代3次，收獲第4代的病毒液作為毒種，將其命名為LJS091151，分裝保存于-20℃。

1.4 病毒毒價測定 將收集的第4代毒種以PBS進行10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種4枚10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，每日觀察記錄直至d7。根據(jù)CAM病變，按Reed-Muench法計算EID50。

1.5 動物回歸實驗 將第4代毒種以喉內(nèi)方式接種8周齡SPF雞15只（1 mL/只）。同時設有正常對照SPF雞10只，隔離器飼養(yǎng)，逐日觀察記錄發(fā)病情況，對發(fā)病雞進行剖檢，觀察病理解剖學變化，并采集病變顯著的臟器進行病理組織學切片觀察。

1.6 病毒gB、TK基因擴增與分析 取200 μL收集的第4代毒種，按照基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，同時以本實驗室保存的ILTV WG株病毒液作為陽性對照，以水為陰性對照。

參考GenBank 中公布的ILTVgB基因（登錄號：EU104982）、TK基因（登錄號：GQ499344），在其保守區(qū)域分別設計1對引物。

gBsense: 5'-TTCCGAGATCGAAGAAGTGAG-3'，gBanti-sense: 5'-ACTCTGGTGGCAAGTATCC TGT-3'；

TKsense:5' -TCCGAGTTCGAGAACGATGAC-3'，TKanti-sense: 5'-GAGTGGGTGCCTATCTACGA G-3′。

按照下列體系和條件進行PCR擴增：25 μL反應體系為：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，sense 和 anti-sense 各 1.0 μL (10 pmoL/μL)，DNA 2 μL，rTaq酶 0.2 μL，滅菌超純水補至25 μL。反應條件：95 ℃變性5 min；94 ℃變性10 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸 30 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃ 10 min。反應結(jié)束后，以1%瓊脂糖凝膠進行分析。將擴增獲得的目的片段連接pMD18-T載體，經(jīng)鑒定正確后進行序列測定與分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 經(jīng)尿囊膜方式接種病料的雞胚，在接種第2代時CAM增厚，有大小不等的白色不透明痘斑出現(xiàn)。與相同日齡陰性對照胚體相比，接毒胚體表面嚴重充血出血，胚體發(fā)育情況未見明顯差異。隨著傳代次數(shù)增加，CAM病變越明顯，并且死亡時間變短，集中于接種后的2～5 d。

2.2 病毒毒價測定 將第4代毒種進行EID50測定，結(jié)果顯示，分離毒毒價為2×104EID50/0.2 mL。

2.3 分離毒回歸試驗 SPF雞人工喉內(nèi)接種分離毒，在攻毒后3～5 d就出現(xiàn)了精神沉郁、采食下降、伸頸、張口呼吸等臨床癥狀，個別SPF雞口腔內(nèi)和糞便中均帶有血絲。攻毒后10 d左右癥狀逐漸減輕直至消失。在臨床癥狀最明顯的時期，選取個別雞進行剖殺，剖檢可見喉頭氣管黏膜充血腫脹，黏液分泌情況與對照組相比明顯增多，消化道空虛、黏膜充血腫脹，脾臟略腫大，胸腺有出血點等病理解剖學變化（圖1）。進一步病理組織學切片結(jié)果顯示，氣管出現(xiàn)淋巴組織增生，肺臟動脈充血，副支氣管有大量血液，消化道絨毛上皮脫落，脾臟白髓出現(xiàn)淋巴細胞壞死和胸腺淤血等病理組織學變化（圖2）。

圖1 SPF雞攻毒后病理解剖學觀察Fig.1 The pathological anatomy observation of SPF chicken after challenging

圖2 SPF雞攻毒后病理組織學觀察Fig.2 The histopathology observation of SPF chicken after challenging

2.4 分離毒gB基因、TK基因PCR擴增與序列分析 以提取的LJS091151株基因組DNA和陰陽性對照DNA為模板，PCR擴增gB、TK基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴增獲得的目的條帶分別為567 bp和405 bp，與預期片段大小相符（圖3）。測序結(jié)果表明分離株gB和TK基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列與GenBank中發(fā)表的序列（詳見表1）相似性分別為gB99.85%，99.46%；TK99.28%，99.22%。

圖3 gB基因、TK基因PCR擴增Fig.3 Amplif i cation of gB and TK gene

表1 GenBank中公布的ILTV gB基因、TK基因參考序列Table 1 The sequences of ILTV gB gene and TK gene in GenBank

3 討論

自2009年以來，中國多個養(yǎng)殖場相繼出現(xiàn)以眼結(jié)膜炎，呼吸極度困難，拉綠白色稀糞為特征的呼吸道疾病。該病發(fā)病急，具有較強的傳染性，感染雞群生產(chǎn)性能下降，病禽大多出現(xiàn)急性死亡，死亡率高，并突破了以往的發(fā)病季節(jié)規(guī)律性，給當?shù)仞B(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟損失。

很多學者都以發(fā)病雞的喉頭、氣管及其黏液等作為雞傳染性喉氣管炎病毒分離的理想病料[8-10]。本研究也成功地從臨床采集的疑似感染雞傳染性喉氣管炎的病雞喉頭氣管中分離到了病毒。通過雞胚絨毛尿囊膜接種和動物回歸實驗對分離的病毒進行鑒定，結(jié)果表明，病毒接種SPF雞胚第2代就出現(xiàn)了典型的痘斑；人工接種的SPF雞在攻毒后d 3就出現(xiàn)了張口呼吸，口腔黏液帶血絲等ILTV典型臨床癥狀。剖檢可見喉頭氣管黏膜充血腫脹；病理組織切片顯示氣管出現(xiàn)淋巴組織增生，肺臟動脈充血，副支氣管有大量血液等病理變化。進一步的基因序列分析表明分離株gB和TK基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列與GenBank中發(fā)表的ILTV序列相似性均在 99%以上。綜上所述，證明了本研究分離的病毒為雞傳染性喉氣管炎病毒。

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