傳染性法氏囊病病毒的分離與鑒定

郭露鉸，徐成剛，賈偉新，劉大偉，王雪潔，任 濤

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部新獸藥創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease,IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）引起的危害雛雞的一種急性、高度接觸性、病毒性傳染病[1]。IBDV主要侵害雞的中樞免疫器官，導(dǎo)致免疫抑制，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)其他病原體的易感性[2,3]。自從1979年在北京、上海和廣州等地報(bào)道該病以來(lái)[4,5]，目前IBDV標(biāo)準(zhǔn)毒株、超強(qiáng)毒株及變異株在中國(guó)并存，導(dǎo)致免疫過(guò)IBDV疫苗的雞群發(fā)病的情況經(jīng)常發(fā)生，給防疫該病帶來(lái)了較大的困難。

IBDV屬 雙RNA病 毒 科（Birnaviridae） 雙RNA病毒屬（Birnavirus）[6,7]?；蚪M包括A、B兩個(gè)片段，編碼VP1到VP5 五種病毒蛋白，其中由A片段編碼的VP2是病毒的主要保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原的變異以及毒力有關(guān)[8]。

通過(guò)對(duì)不同毒株VP2氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在VP2蛋白206～350位區(qū)域內(nèi)的氨基酸變化較大，稱為IBDV高變區(qū)[9]。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)近幾年廣東省IBDV分離株的VP2基因高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序分析，從分子水平探討廣東省IBDV分離株的流行情況，為更好地防制該病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 8株IBDV分離毒為2009～2011年期間分離自廣東省的傳染性法氏囊病發(fā)病雞場(chǎng)，具體背景見(jiàn)表2。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和試劑 大腸桿菌DH5α菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供；RNAiso Reagent、dNTP、SuperscriptTM RT-PCR Systems試劑盒、TaKaRa ExTaqDNA Polymerase、DNA Marker（DL 2000）等購(gòu)自TaKaRa(大連)公司；DNA凝膠純化試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品；瓊脂糖、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出物（Yeast Extract）為OXOID產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 SPF雞胚及試驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚及試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集與處理 從IBD發(fā)病雞場(chǎng)的病死雞體內(nèi)采集病變嚴(yán)重的法氏囊組織，凍存，帶回實(shí)驗(yàn)室，病料相關(guān)資料詳見(jiàn)表2。

按OIE手冊(cè)中診斷與疫苗標(biāo)準(zhǔn)部分關(guān)于IBDV病料處理的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[1]：將凍存的病料融化后剪碎，放入研磨器中，加入滅菌PBS（1 g/mL）研磨（加入青鏈霉素，終濃度為1 mg/mL），得到懸濁液；加入等體積氯仿，在低溫旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)24 h（200 r/min） ；4 ℃ 1000×g離心 30 min，將上清液移入無(wú)菌的小試劑瓶中，-70 ℃保存。

1.2.2 病毒的分離與純化 將上述處理后的病毒原液用PBS 104倍稀釋后，以0.2 mL/胚接種于10 日齡SPF 雞胚的絨毛尿囊膜中，然后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)，棄去24 h內(nèi)的死胚，其余的繼續(xù)培養(yǎng)至120 h后轉(zhuǎn)入4℃冷凍過(guò)夜，次日收集絨毛尿囊膜并觀察膜的病變情況，如此進(jìn)行反復(fù)傳代至第3代，收集的絨毛尿囊膜毒作為試驗(yàn)用種毒。

1.2.3 IBDV基因組RNA的抽提 按照TRIzol試劑說(shuō)明提取病毒RNA，加入適量的DEPC處理水溶解。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)IBDV P2株A節(jié)段VP2基因的ORF序列（GenBank登錄號(hào)為X84034），用Oligo6.0設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增分離毒株VP2基因高變區(qū)的特異性引物VP2-F 和VP2-R(VP2-F :5'-TGTAAAACGACGGCCAGTGCAT GCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3' ; VP2-R :5'-CAGGAAACAGCTATGACCGAATTCGATCCT GTTGCCACTCTTTC- 3'），預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段600 bp左右，引物由英俊生物技術(shù)有限公司（Invitrogen）合成。

1.2.5 病毒的RT-PCR擴(kuò)增 按照TaKaRa公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行VP2基因的反轉(zhuǎn)錄。在20 μL反應(yīng)體系中加入以下各組分：病毒總RNA溶液9.5 μL、20 pmol/μL隨機(jī)引物（R:O）1.0 μL、RNA 酶 抑 制 劑（40 U/μL）0.5 μL、5×RTase M-MLV Buffer 4.0μL，dNTPs（2.5mmol/L）4.0μL、AMV 1.0 μL，瞬時(shí)離心混勻，室溫靜置10 min后置42 ℃水浴鍋中溫育1 h，然后立即冰浴3 min 用于VP2基因的PCR 擴(kuò)增。

在25 μL 的PCR 體系中加入以下各組分：10×ExTaqTMBuffer 2.5 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 2.0 μL、模板（RT product）1.0 μL、上游引物 OIE-F(20 pmol/μL) 0.5 μL、 下 游 引 物 OIER(20pmol/μL) 0.5 μL、去離子水 18 μL，瞬時(shí)離心混勻，然后進(jìn)行以下程序：94℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，循環(huán)29次；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE緩沖液配制1.0%的瓊脂糖凝膠，加入EB至終濃度為0.5 μg/mL。取5 μL的PCR產(chǎn)物檢測(cè)是否擴(kuò)增出VP2基因片段。

1.2.6 目的基因的克隆 將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶進(jìn)行抽提、純化，將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T按要求進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌中，挑取生長(zhǎng)良好的菌落接種于LB培養(yǎng)基中（含AMP+50 mg/L），擴(kuò)增培養(yǎng)，按堿裂解法提取質(zhì)粒，以備進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.7 重組質(zhì)粒的鑒定 將篩選的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為模板，應(yīng)用相同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.8 VP2基因的核苷酸序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析 經(jīng)PCR鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒由上海Invitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)IBDV分離毒株及參考毒株的VP2高變區(qū)核苷酸序列（435 bp）用MEGA4.0軟件中的N-J法構(gòu)建的遺傳進(jìn)化，bootstrap為1000次。所用參考毒株名稱及其 GenBank登 錄 號(hào) 如 下：OKYM（D49706）、UK661（X92760） 、Harbin（AY321955）、GHUT-12（DQ778035）、CJ801（AF416621）、P3009（AF109154）、GZ29112（AF051837）、BK912（AF416620）、B87（DQ202329）、D78（AF499929）、Cu-1M（AF362771）、23-82（AF362773）、OH(M66722）。

1.2.9 病毒ELD50測(cè)定 用滅菌PBS將病毒液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4和10-5等5個(gè)不同稀釋度，每個(gè)稀釋度通過(guò)絨毛尿囊膜接種6枚8日齡SPF雞胚，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)束后按Reed-Muench法計(jì)算分離病毒的ELD50。

1.2.10 對(duì)SPF雞致死率的測(cè)定 將10羽3周齡SPF雞以滴鼻、點(diǎn)眼途徑攻毒，劑量為10ELD50/0.2 mL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，攻毒后連續(xù)觀察直至無(wú)死亡雞出現(xiàn)為止（連續(xù)觀察2周），記錄死亡情況，并計(jì)算病毒對(duì)SPF雞的致死率。

2 結(jié)果

2.1 分離毒株的RT-PCR鑒定結(jié)果 取5 μL RTPCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示（略去毒株名稱），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 PCR amplif i cation of IBDV isolates

2.2 8株IBDV地方分離株VP2基因推導(dǎo)的氨基酸分析 對(duì)8株IBDV地方分離株VP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，與超強(qiáng)毒株特征性氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行比較，結(jié)果如表1。據(jù)其他研究報(bào)道[10]，超強(qiáng)毒株VP2高變區(qū)氨基酸殘基具有3個(gè)典型的特征：（1）249和254位的氨基酸分別為Q和G；（2）保守的SWSGSAS七肽區(qū),且279和284位分別為D和A，而非N和T，這是IBDV毒株具有高致病性的必要條件；（3）222、294和299位具有3個(gè)特征性氨基酸，分別為A、I和S。

表1 IBDV特征性氨基酸位點(diǎn)比對(duì)Table1 Sequence analysis of hypervariable region of VP2 amino acid sequences among different strains of IBDV

2.3 8株IBDV地方分離株VP2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 利用8個(gè)IBDV地方分離株和13個(gè)參考毒株VP2基因高變區(qū)核苷酸序列繪制的IBDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，8株分離毒和4個(gè)超強(qiáng)毒參考株（UK661、Harbin、OKYM及GHUT-12）在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中共同形成一個(gè)大的分支。

圖2 根據(jù)VP2基因高變區(qū)核苷酸序列（435 bp）構(gòu)建的IBDV遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenitic tree based on VP2 high variable region(HVR) of IBDVs

2.4 ELD50及對(duì)SPF雞致死率的測(cè)定結(jié)果 病毒的ELD50及其對(duì)SPF雞的致死率測(cè)定結(jié)果如表2所示。人工接種SPF雞胚絨毛尿囊膜后，8個(gè)IBDV分離株均可在SPF雞胚上復(fù)制并使雞胚致死，但ELD50呈現(xiàn)一定程度的差異。人工感染SPF雞后，8個(gè)分離株對(duì)SPF雞的致死率均達(dá)到60.0%以上，SG-1/11株對(duì)SPF雞的致死率更是達(dá)到了100%，這幾個(gè)毒株均稱為超強(qiáng)毒。

3 討論

IBD是一種重要的雞免疫抑制性傳染病，免疫接種是預(yù)防和控制該病的重要手段。近年來(lái)，變異株和超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)導(dǎo)致IBD頻頻發(fā)生，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害極大。根據(jù)SPF雞的致死率和病毒中和試驗(yàn)可將血清I型的IBDV分為vvIBDV、經(jīng)典毒株和變異毒株。其中超強(qiáng)毒株的致死率很高，但與經(jīng)典毒株相比較抗原性卻無(wú)差異，常用的血清學(xué)手段很難鑒定區(qū)分二者，因此利用分子生物學(xué)對(duì)IBDV分離株進(jìn)行分群具有非常種要意義。另外，通過(guò)對(duì)IBDV的系統(tǒng)進(jìn)化分析，找出毒株的起源與進(jìn)化關(guān)系，可為防控IBD的發(fā)生提供依據(jù)。

表2 病料及病毒情況Table2 Biological characteristic of different strains

目前對(duì)IBDV分子流行病學(xué)研究集中在該病毒VP2基因的高變區(qū)，VP2基因與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原的變異以及毒力有關(guān)[8]，VP2高變區(qū)氨基酸變化較大，因此對(duì)該區(qū)域的分子特征進(jìn)行研究不僅可以發(fā)現(xiàn)IBDV的抗原性變化，還可提供IBDV毒株遺傳進(jìn)化信息。

IBDV毒力變異的分子機(jī)制較為復(fù)雜，曾經(jīng)認(rèn)為VP2高變區(qū)內(nèi)富含S的七肽區(qū)SWSASGS是IBDV毒力的標(biāo)志。1996年，Yamiguchi等[10]發(fā)現(xiàn)將超強(qiáng)毒OKYM株的I256突變?yōu)門(mén)后，毒力變?nèi)?，從而開(kāi)始了IBDV其他毒力位點(diǎn)的研究。279位和284位的氨基酸被認(rèn)為是區(qū)分強(qiáng)弱毒株的關(guān)鍵。強(qiáng)毒株在279位和284位分別是D和A，而弱毒株分別為N和T。這些位點(diǎn)可能導(dǎo)致毒力的變化，但未必是決定因素，IBDV的毒力應(yīng)是由多因子共同決定的。

本研究應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增了8株分離自廣東省不同地區(qū)的IBDV的VP2基因高變區(qū)，通過(guò)推導(dǎo)的氨基酸序列分析顯示，JM-1/10、JM-2/10、SZ-1/10、JM-3/11和SG-1/11分離株的7個(gè)特征性氨基酸位點(diǎn)以及富含絲氨酸的七肽區(qū)均與vvIBDV完全一致。而QY-1/09、QY-2/09、QY-3/09在254及279位存在一到兩個(gè)突變，但是G、D、S、N均屬于親水性氨基酸的替換，并不會(huì)改變相關(guān)區(qū)域的親水性，不影響其成為強(qiáng)毒株[11]。另外通過(guò)與13個(gè)參考株同源性比較可以看出，這8個(gè)分離株與4個(gè)超強(qiáng)毒株同源性較高，在95.1%～99.5%之間，在IBDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中共同形成一個(gè)大的分支。說(shuō)明當(dāng)前在廣東省引起雞傳染性法氏囊病的主要毒株類(lèi)型多為超強(qiáng)毒IBDV。

本次分離的8株病毒對(duì)3周齡SPF雞的致死率均在60.0%以上，有些甚至達(dá)到100%的死亡，與遺傳進(jìn)化分析一致，符合超強(qiáng)毒株的特性。超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，給IBD的免疫帶來(lái)了困難。近幾年IBD疫苗免疫失敗的情況屢屢發(fā)生，除免疫不合理外，抗原變異和毒力增強(qiáng)都可能導(dǎo)致免疫失敗。傳統(tǒng)的經(jīng)典Ⅰ型疫苗是否能提供較好的保護(hù)效果，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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