重組H8N4亞型禽流感病毒的拯救

崔鶴馨 ，李 沂 ，田宇飛 ，袁 森 ，凡 敏 ，靖 杰 ， 齊延新 ，郭歡歡 ，田明堯， 金寧一

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春1300621；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

流感病毒是負(fù)鏈RNA病毒，基因組是分節(jié)段的。最初研究人員通過純化RNPs蛋白來(lái)獲得流感病毒；1989年，研究人員通過輔助病毒獲得了流感病毒；1999年，Neumann等和Fodor等建立了能完全從克隆的cDNA產(chǎn)生流感病毒的新技術(shù)，首次通過12質(zhì)粒系統(tǒng)拯救出流感病毒。至此，反向遺傳操作技術(shù)取得了突破性進(jìn)展。但當(dāng)較多數(shù)量的質(zhì)粒一起進(jìn)入細(xì)胞并協(xié)調(diào)表達(dá)時(shí)，病毒的拯救效率會(huì)受到影響。為了減少質(zhì)粒數(shù)量，2000年Hoffmann等[1]建立了雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體的8質(zhì)粒系統(tǒng), 即在同一載體上實(shí)現(xiàn)vRNA的轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白的表達(dá)。編碼vRNA的cDNA正向插入到RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子（從人巨細(xì)胞瘤病毒CMV啟動(dòng)子衍化而來(lái)）和終止序列（牛生長(zhǎng)激素poly（A）信號(hào)aⅡBGH）之間，并一起反向插入了人RNA 聚合酶Ⅰ啟動(dòng)子（PⅠh）和鼠RNA 聚合酶Ⅰ終止序列（tⅠ），這一系統(tǒng)采用共培養(yǎng)293T 細(xì)胞和MDCK細(xì)胞, 因?yàn)槿说腞NA 聚合酶I啟動(dòng)子只能在人源或相近種屬動(dòng)物細(xì)胞才能表現(xiàn)較高的活性。8個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，在同一個(gè)模板上由RNA聚合酶Ⅰ控制合成負(fù)鏈vRNA，由RNA聚合酶Ⅱ控制合成正鏈mRNA，轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒隨后感染MDCK細(xì)胞并大量復(fù)制并表達(dá)蛋白質(zhì)。 該系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)在于不需要構(gòu)建專門的蛋白表達(dá)質(zhì)粒，使得反向遺傳學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生流感病毒的時(shí)間和成本也隨之縮短和降低。另外，該系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于多種負(fù)鏈RNA病毒的拯救,如狂犬病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒、水皰性口膜炎病毒、麻疹病毒等[2-7]。本研究對(duì)CY015173的H8 HA與CY005359的N4 NA基因進(jìn)行全基因合成，并依次克隆至pHW2000載體，與已經(jīng)構(gòu)建好的pHW2000-PA、pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-NP、pHW2000-NS 、pHW2000-M，組成8質(zhì)粒的拯救系統(tǒng)，成功拯救了H8N4亞型流感病毒。

1 材料和方法

1.1 菌株、細(xì)胞和雞胚 DH5α（大腸桿菌感受態(tài)）克隆載體的宿主菌，本研究室保存；SPF雞胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；MDCK細(xì)胞和293T細(xì)胞由本研究室提供; EGFP由上海生工合成；1%雞血紅細(xì)胞。

1.2 8質(zhì)粒拯救系統(tǒng) pHW2000和6個(gè)質(zhì)粒來(lái)自本研究室保存（pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS），H8HA和N4NA基因片段由上海生工合成。

1.3 酶與試劑EcoR V、EcoR I、Hind III、SalI、KpnI、SmaI、SphI、NdeI、XhoI、BsmB I等限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物公司；質(zhì)粒DNA小量和大量提取試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)?；厥赵噭┖匈?gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；ExTaq酶、T4 DNA 連接酶、RNase購(gòu)自Promega公司；DNA Marker、Low molecular protein marker、胰蛋白胨、瓊脂糖、酵母提取物購(gòu)自華美生物工程公司；GeneCompanion?Ⅰ轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Gene Trans公司；Opti-MEM購(gòu)自大連寶生物有限公司。

1.4 pHW2000-H8和pHW2000- N4的構(gòu)建及鑒定將已構(gòu)建成功的pMD18-H8HA、pMD18-N4NA

轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含有氨芐的LB平板，挑取形狀規(guī)則，大小均一的單菌落。用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，并用BsmB I酶切 pMD18-H8HA、pMD18-N4NA 和 pHW2000，酶切體系：質(zhì)粒8 μL，緩沖液5 μL，BsmB I 2 μL，無(wú)菌ddH2O 35 μL。取5 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結(jié)果。其余的酶切產(chǎn)物經(jīng)酶切產(chǎn)物回收試劑盒純化回收。將純化回收的H8和N4基因及線性化載體PHW2000 用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系：載體片段2 μL、H（N）片段4 μL、T4連接酶1 μL、緩沖液2 μL、蒸餾水11 μL，16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板和挑取單菌落后用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，并用BamH I和XhoI雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送去測(cè)序，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pHW2000-H8和 pHW2000- N4。

1.5 重組H8N4亞型禽流感病毒的拯救 將8質(zhì)粒按試劑盒說明書所要求的稀釋到1μg/μL，將生長(zhǎng)良好的MDCK和293T細(xì)胞接6孔板，當(dāng)其鋪滿80%～90%時(shí)，開始轉(zhuǎn)染。具體操作如下：在EP管架上分兩排放16個(gè)EP管，在每個(gè)EP管中放300 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，前8個(gè)管里放3～4 μL質(zhì)粒，后8個(gè)管里放3～4 μL脂質(zhì)體，混勻靜置5 min。前8個(gè)管分別與后8個(gè)管的液體加在一起，混勻靜置25 min。把混合好的8管液體分別加在6孔板上，每孔100 μL。6 h后每孔補(bǔ)加2 mL DMEM培養(yǎng)基，72 h后將細(xì)胞吹下和上清一起回收。將收取的細(xì)胞液接種至10日齡雞胚尿囊腔，丟棄24 h內(nèi)死亡的，72 h后收取雞胚尿囊液。如此，在雞胚中盲傳3代。在P3實(shí)驗(yàn)室中收取SPF雞胚尿囊液，按照OIE標(biāo)準(zhǔn)用1%的雞胚紅細(xì)胞做血凝試驗(yàn)。

1.6 重組H8N4亞型流感病毒的鑒定

1.6.1 血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn)鑒定流感病毒 血凝實(shí)驗(yàn)即在血凝板上的每個(gè)孔中加入25 μL的生理鹽水，1號(hào)孔中加入25 μL病毒液，以此倍比稀釋，最后一孔棄掉25 μL，并設(shè)不加待檢病毒的紅細(xì)胞對(duì)照孔，在振蕩器上搖勻，置37℃溫箱感作，30 min后觀察結(jié)果。血凝抑制試驗(yàn)即將血凝實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果的抗原稀釋成4單位抗原，然后在血凝板上的每個(gè)孔中加入25 μL的生理鹽水，1號(hào)孔中加入25 μL用生理鹽水5倍稀釋的新鮮血清，以此倍比稀釋，最后一孔棄掉25 μL，最后在每孔中加入25 μL的4單位病毒液，在振蕩器上搖勻，置37℃溫箱感作30 min后，每孔加入25 μL 1%紅細(xì)胞懸液，再在振蕩器上搖勻，置37 ℃溫箱感作30 min后觀察結(jié)果。

1.6.2 PCR鑒定 收集血凝試驗(yàn)陽(yáng)性尿囊液，提取RNA反轉(zhuǎn)錄后，分別用NP的引物、H8的引物、N4的引物做PCR。具體體系如下：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq0.5 μL，模板0.5 μL，無(wú)菌ddH2O15.5 μL。H8上游引物序列：5'-AGCAAAAGCAGGGGTCACA-3'，下游引物序列：5'-AAAACACCCTTGTTTCTACT-3'；N4上游引物序列：5'-AGCAAAAGCAGGAGT-3'，下游引物序列：5'-AAAAAACTCCTTGTTTCTACT-3'。1.6.3 電鏡法鑒定流感病毒 將血凝實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性尿囊液2656×g離心30 min。取上清液體10 μL 。上清液體送至電鏡室經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，鏡下尋找病毒顆粒并照相。

1.7 重配H8N4亞型流感病毒的生物學(xué)特性分析

1.7.1 重組病毒血凝素?zé)岱€(wěn)定性測(cè)定 將H8N4重組病毒分裝至5個(gè)EP管中，400 μL/管，分別放入56 ℃水浴中，放置的時(shí)間分別為0、15、30、60、90 min，然后迅速在4 ℃冰箱中放置10 min。按OIE標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量其血凝效價(jià)。熱穩(wěn)定性劃分標(biāo)準(zhǔn)為：56 ℃水浴條件下以下降2個(gè)滴度為標(biāo)準(zhǔn)，15 min以內(nèi)的為熱不穩(wěn)定型，15～30 min之間的為中等耐熱型，30 min以上的為熱穩(wěn)定型。

1.7.2 重組病毒的耐酸性測(cè)定 將H8N4重組病毒分裝至2個(gè)EP管內(nèi)，1 mL/管。1號(hào)EP管加入pH值為4的鹽酸溶液，室溫作用3 h，再用NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至7；2號(hào)EP管加入生理鹽水室溫作用3 h。將兩管內(nèi)液體分別接種10日齡SPF雞胚，72 h后收集尿囊液，測(cè)其效價(jià)。

1.7.3 重組病毒對(duì)乙醚和氯仿的敏感性試驗(yàn) 將H8N4重組病毒分裝到3個(gè)EP管內(nèi)，1號(hào)EP管液體加入0.25 mL乙醚，室溫作用3 h；2號(hào)EP管液體加入1%氯仿，室溫作用3 h；3號(hào)EP管加入0.25 mL生理鹽水室溫作用3 h。將3個(gè)EP管內(nèi)液體稀釋到10 mL，分別接種10日齡SPF雞胚，72 h后收取尿囊液，測(cè)其效價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 小量提取的重組質(zhì)粒pHW2000-H8和pHW2000-N4分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI在37℃水浴條件下酶切3 h，經(jīng)鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功，結(jié)果如圖1。

圖1 pHW2000-H8 和pHW2000-N4 Bam的HI和Xho I酶切鑒定圖Fig.1 pHW2000-H8 and pHW2000-N4 vector by Bam HI and Xho I

2.2 重組H8N4亞型流感病毒的鑒定

2.3.1 血凝實(shí)驗(yàn)及血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果 血凝試驗(yàn)初步斷定拯救是成功的，部分雞胚尿囊液傳到第三代的時(shí)候出現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)，一般在1～3個(gè)+，有1個(gè)達(dá)到了5個(gè)+。也有在第1～2代時(shí)有陽(yáng)性結(jié)果，而到第3代卻變成了陰性，推斷可能是病毒毒力減弱；血凝抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證證實(shí)了血凝試驗(yàn)的結(jié)果，即血凝試驗(yàn)呈陽(yáng)性的待檢樣品都呈現(xiàn)陰性。

2.3.2 PCR法鑒定重配H8N4亞型流感病毒 用H8的上下游引物進(jìn)行PCR，凝膠電泳見圖2。

圖2 RT-PCR鑒定拯救病毒Fig.2 Identif i cation of virus rescued by RT-PCR

圖3 獲救病毒的電鏡照片(440 000 ×)Fig.3 The electron microscope photograph of rescued viruses(440 000 ×)

2.3.3 電鏡法鑒定流感病毒 電鏡照片結(jié)果顯示，禽流感病毒的形態(tài)多為球狀，大小約為80～120 nm，電鏡下病毒囊膜表面的纖突可以清楚的看到，符合流感病毒的形態(tài)特征，見圖3。

2.4 重配H8N4亞型流感病毒的生物學(xué)特性分析結(jié)果

2.4.1 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)血凝結(jié)果 將重組病毒置于56℃水浴中，放置30 min以上的一組病毒血凝價(jià)下降了2～3個(gè)滴度，放置15～30 min的另一組病毒血凝價(jià)無(wú)明顯變化。說明重配H8N4流感病毒是中等耐熱性毒株。

2.4.2 耐酸性實(shí)驗(yàn)血凝結(jié)果 將鹽酸處理過的病毒接種于10日齡SPF雞胚，未發(fā)現(xiàn)血凝抑制，亦無(wú)感染，而對(duì)照組用生理鹽水處理過的病毒發(fā)生了血凝抑制且效價(jià)較高，證明該病毒對(duì)酸敏感。

2.4.3 對(duì)乙醚和氯仿敏感性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將病毒用乙醚和氯仿處理過后接種SPF雞胚，未發(fā)現(xiàn)血凝抑制現(xiàn)象，而對(duì)照組的血凝抑制現(xiàn)象明顯。說明該病毒對(duì)乙醚和氯仿敏感。

2.5 流感病毒亞型眾多、變異頻率高、重排現(xiàn)象較多，是唯一的能在短時(shí)間內(nèi)引起世界范圍大暴發(fā)的病毒，可以在各年齡段的人群中引起發(fā)病，每次流感大流行都給人類帶來(lái)了巨大的災(zāi)難。傳統(tǒng)的遺傳學(xué)難以應(yīng)對(duì)新出現(xiàn)的毒株及快速掌握其生物學(xué)特性，可導(dǎo)致延誤防控流感的最佳時(shí)機(jī)。

本研究利用霍夫曼8質(zhì)粒拯救流感病毒原理，在前人成功構(gòu)建載體的研究基礎(chǔ)上，重新構(gòu)建了pHW2000-H8和pHW2000-N4質(zhì)粒。通過8質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T和MDCK細(xì)胞，收集病毒液并在SPF雞胚中傳3代。對(duì)收集的尿囊液進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)、RTPCR以及電鏡觀察等實(shí)驗(yàn)，證明H8N4亞型禽流感病毒獲得成功拯救。我們所應(yīng)用的8質(zhì)粒系統(tǒng)不需要單獨(dú)表達(dá)RNPs形成所必需的PB2 、PB1 、PA這三種聚合酶及NP核蛋白，而是利用一個(gè)雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體上的RNA 聚合酶Ⅰ、Ⅱ啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的同步完成，節(jié)省了質(zhì)粒，提高了拯救的效率。

對(duì)重配H8N4流感病毒的部分生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明拯救的H8N4流感病毒是雞胚高復(fù)制性流感病毒，符合一般流感病毒的生物學(xué)特性。由于流感病毒的高危害性和其變異較快且各型之間又不能交叉防護(hù)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將把成功拯救的重配H8N4流感病毒接于動(dòng)物體內(nèi)，進(jìn)一步研究禽流感病毒的變異機(jī)理，為流感減毒活疫苗的研制等奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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