一株新型鴨源呼腸孤病毒（TH11株）的分離與鑒定

陳宗艷，朱英奇，王世傳，李傳峰，李 露，王玢繽，付玉志，高景鵬，王 超，劉光清

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.安徽省全椒縣畜牧獸醫(yī)局, 全椒 239500）

2011年上半年，中國(guó)太湖流域的許多養(yǎng)鴨場(chǎng)陸續(xù)發(fā)生一種新的鴨病毒性傳染病，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)病雛鴨軟腳，排白色稀糞，發(fā)病率約20%～60%，病死率在80%以上，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該類病例的臨床病變主要為：肝臟呈土黃色，質(zhì)脆，有點(diǎn)狀、斑塊狀出血，或黃白色壞死灶；脾臟腫大、出血，呈暗紅色，有多處大小不等的淡黃色壞死灶；其他臟器也表現(xiàn)出不同程度的腫大或出血等。為了查明該病的病原，我們對(duì)采集的病死鴨病料進(jìn)行了病原分離和鑒定。初步研究結(jié)果表明，造成該次疫情的病原是一種不同于番鴨呼腸孤病毒的新型呼腸孤病毒。

1 材料與方法

1.1 材料 病料采集于安徽省太湖縣某養(yǎng)鴨場(chǎng)；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；SPF鴨胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑 Tissue DNA/RNA Kit 、PremixTaqTM（ExTaqTMVersion）、DNA Marker（DL2000）購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自GBICO公司。

1.3 病毒分離 將病料剪碎，按1:5體積加生理鹽水，勻漿器勻漿后反復(fù)凍融3次，10 800×g、4 ℃離心30 min，吸取上清液，0.22 μmol/L濾膜過濾除菌。取上述濾液接種按常規(guī)方法[1]制備的鴨胚成纖維細(xì)胞（Duck embryo fibroblasts, DEFs），出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞液。過濾除菌的濾液同時(shí)經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡雞胚10枚，接種量為0.2 mL/枚。接種后，置37 ℃生化培養(yǎng)箱恒溫孵化。棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，每間隔12 h觀察一次，收獲死亡的胚體及尿囊液并記錄結(jié)果。連續(xù)傳3代，至該病毒致死雞胚穩(wěn)定為止。

1.4 病毒半數(shù)雞胚致死量（ELD50）的測(cè)定 將分離株病毒懸液作10倍系列稀釋，取105、106、107、108稀釋度接種雞胚，0.1 mL/個(gè)，每一稀釋度接種5個(gè)雞胚，觀察記錄雞胚的死亡數(shù)，計(jì)算各稀釋度的百分率。按Reed 和Muench 法計(jì)算病毒半數(shù)致死量（ELD50）[2]。

1.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 1日齡健康太湖麻鴨20只，隨機(jī)分為攻毒組和對(duì)照組，各16只和4只。攻毒組中8只鴨皮下注射病毒液0.5 mL，8只鴨口服病毒液0.5 mL。

1.6 電鏡觀察 收集病毒感染的雞胚尿囊液, 以4℃、15 000×g離心30 min（Beckman）以除雜蛋白，上清轉(zhuǎn)移至鋪有蔗糖（40%，W/W；PBS 配制）墊層的離心管中，于4 ℃、45 000×g（rotor SW32 Ti, Beckman）離心3 h。超離后的沉淀用水重懸,取樣使用磷鎢酸負(fù)染后于JEM-1200EX電子顯微鏡下觀察。

1.7 RT-PCR檢測(cè) 按照Tissue DNA/RNA Kit說明書從細(xì)胞裂解液中提取病毒總RNA，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄后做為模板擴(kuò)增全基因。根據(jù)禽源呼腸孤病毒S2基因的部分序列設(shè)計(jì)特征性引物：上游引物P1: 5'-GCATGAACATGCCAGTTGAG-3'；下游引物P2: 5'-AAGCCATAACGATGGCAGTC-3'，其擴(kuò)增長(zhǎng)度為320 bp。引物由上海英駿生物公司合成。PCR 反應(yīng)體系為: 2×PCRTaqMix 25 μL、上游引物（50 μmol/L）1μL、下游引物（50 μmol/L）1 μL、cDNA 模板4 μL、無菌ddH2O 19 mL，總體積為50 μL。反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min ；94 ℃變性40 s ，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用AXYGEN Gel Ext reaction Kit回收純化后，將擴(kuò)增的片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α ，挑菌落PCR 鑒定，得到含目的片段的重組陽性菌株，用于測(cè)序分析。

1.8 序列測(cè)定及分析 將陽性克隆送上海桑尼工程有限公司測(cè)序,使用DNAStar、Mega4.1軟件對(duì)測(cè)定的病毒核苷酸序列與GenBank中收錄的禽源呼腸孤病毒的序列進(jìn)行同源性比對(duì)和分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 將病毒液接入DEFs細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)細(xì)胞堆聚，細(xì)胞核濃縮，胞間界限模糊，部分細(xì)胞脫落，有噬斑形成（圖1）。培養(yǎng)72 h后，大部分細(xì)胞脫落。

將病毒液接種雞胚后，雞胚在60～84 h死亡，表現(xiàn)為胚胎蜷縮，體表充血、出血嚴(yán)重，全身彌漫針尖大小的出血點(diǎn)；內(nèi)臟病變主要表現(xiàn)為肝臟腫大、質(zhì)脆，出血明顯，有邊緣壞死灶（圖2）。此外，病變呈漸進(jìn)性，早期死亡胚肝臟出血比較多見，但隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng)，胚體肝臟出現(xiàn)邊緣壞死增多。

2.2 病毒半數(shù)雞胚致死量（ELD50） 分離到的毒株命名為TH11。其ELD50測(cè)定結(jié)果為：ELD50=107.1/0.2 mL。

2.3 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn) 兩種攻毒途徑的鴨均在接毒后d 3發(fā)病，接毒后5 d內(nèi)死亡，其發(fā)病率和死亡率分別為100%（8/8）和100%（8/8）。發(fā)病鴨精神萎靡，排白色稀糞。剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟呈土黃色，質(zhì)脆，有點(diǎn)狀或斑塊狀出血；脾臟腫大，呈暗紅色,有多處約2 mm大小不等的淡黃色壞死點(diǎn)；腎臟表面出血（圖3）。對(duì)照鴨無臨床癥狀。臨床自然病死鴨的臨床病理變化與上述基本一致。

圖1 分離的鴨源呼腸孤病毒TH11株引起鴨胚成纖維細(xì)胞的病變情況Fig.1 Cytopathic effect on duck embryo fi broblast induced by DRV-TH11 isolate

圖2 DRV-TH11接種雞胚Fig.2 Lesions of chick embryo experimentally infected with DRV-TH11

表1 DRV-TH11分離株接種雞胚死亡率Table 1 Mortality rate of chick embryo experimentally infected with DRV-TH11 strain

圖3 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)Fig.3 Lesions of ducks experimentally infected with DRV-TH11

2.4 電鏡樣品的制備及觀察 收集的病毒尿囊液經(jīng)蔗糖墊底超速離心后，管底有沉淀聚集。使用PBS懸浮沉淀，取少量經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，電鏡觀察，可觀察到具有典型呼腸孤病毒形態(tài)學(xué)特征的病毒顆粒（圖4）。

圖4 電鏡觀察超速離心純化的病毒粒子Fig.4 Observation of purif i ed DRV-TH11 particles by electron microscopy

2.5 基因同源性比較和進(jìn)化樹分析 從攻毒細(xì)胞裂解液中提取病毒RNA，用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行RT-PCR，可以獲得預(yù)計(jì)大小的片段(圖5)。經(jīng)過序列測(cè)定和分析，獲得320 bp核苷酸序列。將其與GenBank中的參考毒株DRV（JF320803）、DRV（HM591300）、DRV（FJ858376）、MDRV（AY219225）、MDRV（AY962265）、MDRV（EF076764）、MDRV（AY962259）、MDRV（AY589090）、MDRV（DQ013347）、MDRV（DQ013346）、MDRV（DQ013348）、MDRV（AJ278102） 的S2基因的部分核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明: 核苷酸序列同源性分別為 97%、96%、95%、92%、92%、92%、92%、92%、92%、92%、91%、90%。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，DRV-TH11與2009年從福建分離的DRV毒株（JF320803）親緣關(guān)系較近，而與番鴨源呼腸孤病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖5 RT-PCR擴(kuò)增DRV-TH11Fig.5 RT-PCR amplif i ed product of DRV-TH11

圖6 DRV-TH11與其他參考毒株S2基因部分序列的遺傳進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree of partial S2 gene between DRV-TH11 and other Arian reovirns(ARV)

3 討論

禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）是呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬的成員，為無囊膜、雙股分節(jié)段的RNA 病毒。ARV呈世界性分布，可感染雞、火雞及其他水禽類[3-5]。胡奇林等[5]分別在福建省、廣東省以肝、脾表面有大量壞死點(diǎn)為主要病理變化的病番鴨中分離到呼腸孤病毒，將其命名為番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）。ARV與番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV） 在致病性、抗原性、電泳圖譜、病毒基因編碼蛋白的順序，以及病毒基因間的同源性方面存在著很大的差異。程安春等[7]根據(jù)“Koch假說”，認(rèn)為四川省的患病鴨中存在一種新的病毒性傳染病，并根據(jù)病毒的特性建議將分離毒劃歸呼腸孤病毒科，其名稱暫定為“鴨病毒性腫頭出血癥病毒”（Duck viral swollenhead haemorrhagic disease virus），但未見有病毒分離報(bào)道。2008年，劉紅等[8]對(duì)廣東省某市一種以腫頭、軟腳、流淚，拉黃綠色稀便，肝出血和壞死及食道泄殖腔潰瘍和結(jié)痂為主要特征的鴨病。在進(jìn)行病因調(diào)查時(shí)，他們分離到多株病毒，其中包括1株呼腸孤病毒DRV-GZ 株。陳少鶯等[9]從臨床表現(xiàn)為肝臟不同程度點(diǎn)斑塊狀出血和壞死點(diǎn)灶為主要病變的病死雛番鴨、雛半番鴨和雛麻鴨肝脾組織中分離到呼腸孤病毒，并證明它是鴨出血性壞死性肝炎的病原。2011年，Liu等[10]從臨床解剖以脾壞死為特點(diǎn)的北京鴨中分離到DRVHC株，其動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)表明，DRV-HC在15 d內(nèi)引起未能引起鴨的死亡，但能引起SPF雞的死亡。

本研究從以脾臟壞死，肝臟點(diǎn)狀或斑塊狀出血為主要特征的，臨床表現(xiàn)為站立不穩(wěn)的病死鴨中分離到鴨源呼腸孤病毒。透射電鏡觀察證明該病毒粒子具有呼腸孤病毒粒子的特征。經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn), 該病毒能高度致死實(shí)驗(yàn)感染鴨，產(chǎn)生與臨床自然病死鴨基本一致的臨床病理變化。初步表明分離毒是鴨站立不穩(wěn)、脾壞死的病原。依據(jù)上述特性，認(rèn)為該分離毒株有別于以往的分離株，我們將此分離毒歸屬于呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬新型鴨呼腸孤病毒（DRV-TH11）。與經(jīng)典的番鴨源呼腸孤病毒不同，本研究中分離的DRV-TH11株不僅能致死雞胚，還可在DEFs中良好增殖。另外，與DRV-HC株相比較，DRV-TH11的致病性更強(qiáng)，其毒力變異的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

為了探討TH11株與國(guó)內(nèi)、外參考毒株之間的遺傳關(guān)系，我們將TH11株的S2基因部分核苷酸序列與參考毒株進(jìn)行了比對(duì)和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TH11株與番鴨呼腸孤病毒的同源性比較低（90%～92%），而與新近報(bào)道的麻鴨源呼腸孤病毒的同源性則較高（95%～97%）。系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果也顯示，TH11與 新型鴨呼弧腸孤病毒（如福建分離株（JF320803））處于同一進(jìn)化分支，具有較近的親緣關(guān)系，而與早期的番鴨呼腸孤病毒則處于不同的分支，據(jù)此，我們推測(cè)當(dāng)前在中國(guó)鴨群中流行鴨呼腸孤病毒病是由一種新型鴨呼腸孤病毒引起的。至于該病原是由番鴨呼腸孤病毒變異而來，還是一種新出現(xiàn)的病原，目前尚缺乏充分的證據(jù)。

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