家禽MSTN基因轉(zhuǎn)錄子的克隆及真核表達

胡 蘭，隋世慧

（沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，沈陽 110161）

肌生成抑制素基因（Myostatin，MSTN）是1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的生長因子，該基因編碼的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)化因子β（TGF-β）超家族中的一員；但是，MSTN基因編碼蛋白與TGF-β超家族其他成員的同源性比較低，最高不超過45%[1]。研究發(fā)現(xiàn)該基因?qū)趋兰〉纳L具有負調(diào)控作用，因此將其命名為肌生成抑制素基因。MSTN基因缺失鼠肌肉增大，骨骼肌肌群分布更廣泛，體重大約是野生鼠2倍[2]；Grobet發(fā)現(xiàn)雙肌牛中該基因發(fā)生突變，在同樣喂食條件下，雙肌牛比普通牛多提供30%的肉產(chǎn)品[3]。已經(jīng)證明MSTN基因存在于各種動物體內(nèi)，其中豬MSTN cDNA全部序列為1 253 bp，牛、雞、鵪鶉、鴿子和鵝的MSTN cDNA均為1 128 bp，擔尼魚MSTNcDNA為1 125 bp，鯰魚MSTNcDNA為1 170 bp。除魚類外，該基因核苷酸序列在不同物種間具有較強的保守性。小鼠、大鼠、人、豬、雞、火雞MSTNcDNA的C端序列同源性為100%；而狒狒、牛和綿羊比較僅有1～3個堿基的區(qū)別[4-6]。

Robers等首次在大馬哈魚不同組織里發(fā)現(xiàn)MSTN蛋白的兩個異構(gòu)體[7]；同年10月，在大馬哈魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩種MSTNmRNA，將其分別命名為MSTNⅠ和MSTNⅡ；后又進一步證明MSTNⅠ和MSTNⅡ轉(zhuǎn)錄子在魚胚和成年魚中都有表達[8]。Biga等報道在斑馬魚體內(nèi)亦存在兩種MSTNmRNA[9]；2005年，Kerr等通過試驗證明這種現(xiàn)象在魚體內(nèi)普遍存在[10]。Garikipati等報道在大馬哈魚體內(nèi)普遍存在4種不同的MSTN基因，分別命名為rtMSTN-1a， rtMSTN-1b， rtMSTN-2a 和 rtMSTN-2b[11]。

到目前為止，除在魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)不同的MSTNcDNA，在其他動物均未見報道。我們在以前的研究工作中偶然發(fā)現(xiàn)家禽體內(nèi)可能存在有多種MSTNcDNA。本研究旨在利用分子生物學手段，確定家禽體內(nèi)MSTN基因轉(zhuǎn)錄子的種類、序列差異及真核表達情況，從而為進一步研究該基因的作用途徑及調(diào)控機制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

試驗用海蘭雞、白羽雞和壽光雞由沈陽農(nóng)業(yè)大學種雞場提供，每個品種數(shù)量為3只，均為1日齡。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

工程菌株DH5α、scs110、TA克隆載體pMD-18 T simple vector購自寶生物工程（大連）公司；質(zhì)粒pEGFP-N1均為本實驗室保存產(chǎn)品，

1.1.3 工具酶和主要試劑

RNAiso Reagent、 RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、DH5α感受態(tài)細胞、限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI（購自大連寶生物公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（購自GIBCO公司）；Lipofectamine2000脂質(zhì)體（購自Invitrogen公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 腿雞總RNA的提取

在無菌條件下，將1日齡壽光、海蘭、白羽雞處死、取腿肌，迅速將其放入-80℃超低溫冰箱以備用；利用總RNA提取試劑盒提取腿肌總RNA。

1.2.2 RT-PCR引物設計與合成

根據(jù)GenBank中的雞MSTN基因序列，利用Primer(version 5.0)和Oligo6.22軟件設計一對寡核苷酸引物，兩引物內(nèi)包含MSTN基因的全部開放閱讀框，并在上下游引物的5'端分別加入保護堿基和酶切位點。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列如下：

上游引物 5'CCGCGGGATCCATGCAAAAGC TAGCAGTCTATGTTT 3'（引入BamH I酶切位點）；

下游引物 5'ACCGCCCTCGAGTCATGAGCAC CCGCAACGATCTACAA 3'（引入XhoI酶切位點）。

1.2.3 MSTN cDNA擴增

RT-PCR反應按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0說明書進行。反轉(zhuǎn)錄反應條件：42℃30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。PCR擴增反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸2 min 30 s，35個循環(huán)，72℃終止5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，染色后于紫外光下照相。

1.2.4 MSTN cDNA的克隆和測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠純化后進行TA克隆，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)、提取質(zhì)粒，單、雙酶切鑒定，將篩選出來的陽性TA克隆質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.2.5 真核表達載體的構(gòu)建

用BamH I/XhoI雙酶切pEGFP-N1表達載體和用TA克隆陽性質(zhì)粒，電泳檢測并回收酶切產(chǎn)物，按照表達載體：目的片段=3∶2的比例16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化、鑒定方法同TA克隆。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-cMSTN-1和pEGFP-N1-cMSTN-2。

1.2.6MSTN基因在鴨胚成纖維細胞中的表達

常規(guī)方法培養(yǎng)14日齡鴨胚成纖維細胞，待細胞長滿瓶底傳代鑒定為成纖維細胞后，調(diào)整細胞濃度為2×106個·mL-1，鋪6孔板。按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，每孔加入0.5 mL轉(zhuǎn)染混合物，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染1 h后，再加入完全培養(yǎng)基至5 mL·孔-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.7 轉(zhuǎn)染細胞中MSTN蛋白表達的檢測

轉(zhuǎn)染后48 h，用熒光顯微鏡觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達情況，利用RT-PCR檢測瞬時轉(zhuǎn)染細胞的MSTN mRNA量以及利用SDS-PAGE電泳分析表達產(chǎn)物水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSTN基因的RT-PCR結(jié)果

以1日齡海蘭雞、白羽雞、和壽光雞腿肌為試材，進行RT-PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1，擴增產(chǎn)物均呈現(xiàn)3條清晰電泳條帶。其中一條電泳帶在1.1 kb處，與已經(jīng)報道的雞MSTN cDNA全長序列大小相符；另外，在750和1 000 bp處也均有清晰條帶。

圖1 MSTN基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis map ofMSTN geneRT-PCR products

2.2 MSTN cDNA的克隆及鑒定結(jié)果

2.2.1MSTNcDNA重組質(zhì)粒的PCR鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，回收1.1 kb、1.0 kb及750 bp處的目的片段，分別命名為cMSTN-1、cMSTN-2和cMSTN-3。分別將海蘭雞、白羽雞和壽光雞中的這三種目的片段與pMD18-T simple Vector連接、轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過藍白斑篩選后，分別隨意調(diào)取1瓶陽性菌液，進行菌液PCR鑒定見圖2。將通過以上鑒定為陽性的克隆分別命名為pMD-cMSTN-1、pMD-cMSTN-2和pMD-cMSTN-3。

圖2 重組質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis map of recombinant plasmid by PCR

2.2.2MSTNcDNA重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

利用BamH I與XhoI雙酶切海蘭雞、白羽雞和壽光雞的pMD-cMSTN-1、pMD-cMSTN-2和pMD-cMSTN-3重組質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物進行電泳鑒定見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切電泳檢測結(jié)果Fig.3 Electrophoresis map of recombinant plasmid digested byBamH I andXhoI

2.3 MSTN cDNA序列測定及分析

2.3.1MSTNcDNA序列測定結(jié)果

將海蘭雞、白羽雞和壽光雞的pMD-cMSTN-1、pMD-cMSTN-2和pMD-cMSTN-3共9種質(zhì)粒送交寶生物工程（大連）有限公司進行測序，海蘭 雞 的 pMD-cMSTN-1、pMD-cMSTN-2和pMD-cMSTN-3測序結(jié)果如下：

上述結(jié)果表示時，采用“…”表示缺失序列。序列測定結(jié)果表明海蘭雞、白羽雞和壽光雞腿肌均同時存在三種MSTN基因轉(zhuǎn)錄子，分別命名為 cMSTN-1、 cMSTN-cMSTN-3。 cMSTN-1 由1 128 bp組成，cMSTN-2由985 bp組成，cMSTN-3由754 bp組成。cMSTN-2與cMSTN-1相比，缺失了374～517 bp處的143 bp，同時有3處堿基不同。cMSTN-3與cMSTN-1相比，缺失了374～748處的374 bp，同時有26處堿基不同。cMSTN-3與cMSTN-2相比，缺失374～748處的231 bp。

2.3.2 不同品種家禽cMSTN-1的比較分析

將海蘭雞、白羽雞和壽光雞的cMSTN-1與設計引物時參考的GenBank上的雞MSTN基因序列（gb：AF019621.1）進行比較，結(jié)果表明海蘭雞和白羽雞的cMSTN-1與設計引物時參考的GenBank上的雞MSTN cDNA序列同源性達100%；壽光雞的csMSTN-1同源性達99.9%，在1 115 bp處發(fā)生堿基突變，由G→A。同時，也對其編碼的氨基酸進行了差異分析，海蘭雞和白羽雞的第1 115核苷酸組成的密碼子為UGC，編碼半胱氨酸，而壽光雞第1 115核苷酸組成的密碼子為UAC，編碼酪氨酸。

2.3.2 不同品種家禽cMSTN-2和cMSTN-3的比較分析

由于cMSTN-2和cMSTN-3是新發(fā)現(xiàn)的兩種MSTN基因轉(zhuǎn)錄子，沒有其他參考數(shù)據(jù)，本研究中僅對我們測定的三個品種家禽進行了比較。海蘭雞、白羽雞和壽光雞的cMSTN-3同源性達100%。在這三個家禽品種中cMSTN-2核苷酸和編碼氨基酸的差異見表1。

表1 海蘭雞、白羽雞和壽光雞cMSTN-2編碼氨基酸的差異Table 1 Differences of cMSTN-2 among Hailan,Baiyu and Shouguang Chicken

由表1可見海蘭雞和白羽雞的cMSTN-2與壽光雞的cMSTN-2相比均有5處堿基不同，而海蘭雞和白羽雞相比只存在2處堿基不同。同時，對其編碼的氨基酸進行推測，海蘭雞和白羽雞只有一個氨基酸差別，而壽光雞和海蘭雞有3個氨基酸不同，壽光雞和白羽雞都存在2個氨基酸不同。另外，通過序列分析發(fā)現(xiàn)在cMSTN-2的388～390處，出現(xiàn)UAA終止密碼子，所以推測如果cMSTN-2編碼蛋白，可能只有129氨基酸，亦即在其形成的蛋白質(zhì)中最多只有一個氨基酸不同。

2.4 重組表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定

由于cMSTN-2和cMSTN-3是新發(fā)現(xiàn)的兩種轉(zhuǎn)錄子，為了確定其在真核細胞中的表達情況，試驗中選擇泰昌雞cMSTN-2和cMSTN-3作為代表，構(gòu)建pEGFP-N1-cMSTN-2和pEGFP-N1-cMSTN-3真核表達載體。利用BamH I+XhoI雙酶切重組質(zhì)粒鑒定，得到預期大小的片段見圖4，表明目的基因成功插入pEGFP-N1載體。

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果Fig.4 Double digestion of recombinant plasmid with BamH I plusXhoI

2.5 轉(zhuǎn)染細胞中MSTN基因的RT-PCR檢測

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pEGFP-N1-cMSTN-2和pEGFP-N1-cMSTN-3轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞，48 h后，收集培養(yǎng)細胞，提取質(zhì)粒、進行RT-PCR鑒定，電泳后分別得到兩個預期的目的片段（見圖5）。

2.6 轉(zhuǎn)染成纖維細胞的顯微觀察

pEGFP-N1-cMSTN-2和pEGFP-N1-cMSTN-3轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞48 h后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有綠色熒光（見圖6），說明成功轉(zhuǎn)染。

圖5 重組質(zhì)粒的PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR identification of recombinant plasmid

2.5 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

轉(zhuǎn)染48 h后，通過蛋白質(zhì)分離、SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果見圖7。由圖7可見，在成纖維細胞pEGFP-N1-cMSTN-2表達蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為15 ku。pEGFP-N1-cMSTN-3沒有明顯蛋白表達條帶。

圖7 轉(zhuǎn)染48 hMSTN蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE analysis of the MSTN protein after 48 h of tranfection

3 討論與結(jié)論

試驗中，考慮到試驗動物的代表性，分別選擇海蘭雞、白羽雞和壽光雞作為蛋雞、肉雞和蛋肉兼用品種的代表。海蘭雞是我國主要飼養(yǎng)的蛋雞品種之一，特點是適應性強，抗病率高，飼料能量要求低，生產(chǎn)可利用種蛋數(shù)量多。白羽雞是我國重要的肉雞品種，其生長發(fā)育快，飼料轉(zhuǎn)化率高，肉用性能優(yōu)良。壽光雞是我國蛋肉兼用的地方優(yōu)良品種之一，軀體高大、骨骼粗壯、蛋質(zhì)濃稠、肉質(zhì)鮮美是其主要特點。研究結(jié)果表明這3個品種的腿肌均存在3種MSTN轉(zhuǎn)錄子，而且其序列大小一致。從測定結(jié)果推斷，家禽中可能普遍存在3種MSTN轉(zhuǎn)錄子，大小分別為1 128、985和754 bp?，F(xiàn)已證明cMSTN-1除在家禽骨骼肌中表達外，在心肌、腸、脾臟、腦中也有少量表達；其表達蛋白大小約為43 ku[12]。家禽中存在的cMSTN-1、cMSTN-2和cMSTN-3與已經(jīng)報道的大馬哈魚體內(nèi)的MSTN轉(zhuǎn)錄子有很大差異，大馬哈魚體內(nèi)MSTNⅠmRNA由2 346個核苷酸組成，MSTNⅡmRNA由1 409個核苷酸組成[13]。

序列分析結(jié)果表明壽光雞cMSTN-1序列和其他兩種家禽有所不同，在1 115 bp處發(fā)生堿基突變，由G變?yōu)锳，結(jié)果導致其編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)槔野彼幔@一結(jié)果可能與壽光雞的體型高大有密切關系。在海蘭雞、白羽雞和壽光雞品種間，cMSTN-2序列的同源性沒有cMSTN-1高，而且在388～390處出現(xiàn)終止密碼子，推測該序列可能起到調(diào)控功能，但作用途徑有待進一步研究。三種不同品種家禽的cMSTN-3序列完全相同，而且均與cMSTN-1和cMSTN-2序列差異較大，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明pMD-cMSTN-3在成肌細胞中不表達；試驗后續(xù)又對家禽cMSTN-1、cMSTN-2和cMSTN-3在DNA水平上的相應序列進行研究，現(xiàn)已證實cMSTN-3的相應DNA序列不含有內(nèi)含子，推測cMSTN-3是由假基因轉(zhuǎn)錄生成，但其功能有待深入研究。

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