斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達(dá)

趙冬梅，陶 妍

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

Boman首先從惜古比天蠶蛹（Hyalophora cecropia）的免疫血淋巴細(xì)胞中分離到高效抗菌肽cecropin以來[1]，至今已經(jīng)有約2 000多種抗菌肽被分離，主要來自于兩棲動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、鳥類、魚類、哺乳動(dòng)物和人類[2]?？咕囊话銥楦缓瑤д姾砂被岬膲A性小分子，氨基端親水、羧基端疏水，具有兩性性質(zhì)及廣譜抗菌性[3]，被認(rèn)為是抗生素的最佳替代品。此外，部分抗菌肽對(duì)胰蛋白酶或胃蛋白酶穩(wěn)定，并對(duì)某些真菌、原蟲、病毒和癌細(xì)胞具有殺傷作用[4]。

Hepcidin又稱LEAP-1(Liver-expressed antimicrobial peptide 1)，是一種主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的小分子陽離子肽，具有較廣譜抗菌活性。它是由Kruase等[5]于2000年首次從人血清中分離出，次年又由Park等[6]從人尿液中分離，以后從哺乳動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物和魚類中亦發(fā)現(xiàn)類似于hepcidin的同源基因[7]。hepcidin的成熟肽存在三種形式，分別為25個(gè)氨基酸（Hepc 25)、22個(gè)氨基酸(Hepc 22)和20個(gè)氨基酸(Hepc 20)的小肽，Hepc 25是主要存在形式。機(jī)體細(xì)胞中的hepcidin含量甚微，提取純化困難，而化學(xué)合成成本高，根本無法大量獲得。因此，基于重組DNA表達(dá)的基因工程技術(shù)無疑是制備hepcidin抗菌肽的最佳方法[8-10]。

近年來關(guān)于抗菌肽重組DNA表達(dá)方面的研究報(bào)道不少，但主要集中于哺乳類、昆蟲類和兩棲動(dòng)物等[7]。相比之下，關(guān)于魚類抗菌肽基因克隆方面的研究報(bào)道較少，Bao等通過對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）進(jìn)行細(xì)菌感染試驗(yàn)，從其肝臟中分離和克隆了hepcidin的全長(zhǎng)cDNA，并考察了該基因在不同組織中的表達(dá)水平[11]。重組DNA技術(shù)在魚類抗菌肽制備中的應(yīng)用則甚少。據(jù)此，本文以斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟組織為材料，以成熟肽為25個(gè)氨基酸的hepcidin為研究對(duì)象，通過RT-PCR對(duì)編碼其原前體肽（包括前體肽和成熟肽）的cDNA進(jìn)行克?。贿x擇pET32a（+）為表達(dá)質(zhì)粒、E.coliBL21（DE3）為工程菌，構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，在IPTG誘導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)hepcidin原前體肽在大腸桿菌中的融合表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

斑點(diǎn)叉尾鮰（體重800 g，體長(zhǎng)35 cm）1尾購自上海市浦東果園農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。鮮活魚運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，立即用鈍器擊殺取其肝臟分割成0.5 cm見方小塊，保存于-80℃冰箱待用。

1.2 總RNA提取和第一股cDNA合成

采用 Trizol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），按照說明書對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的肝臟組織進(jìn)行總RNA提?。?00 mg∶1 mL），經(jīng)75%乙醇純化后的總RNA溶解于10 μL DEPC·H2O中。

第一股cDNA的合成根據(jù)M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit（Takara，Otsu，Japan）說明書進(jìn)行。2 μL總RNA、5 μL AP（Adapter Primer）通用引物、2 μL ddH2O混勻，70℃保溫10 min，冰浴1～2 min；依次 加 入 4 μL 5 × First strand buffer、 4 μL dNTP mixture（2.5 mmol·L-1）、 2 μL DTT（0.1 mol·L-1），42℃保溫2 min，再加入1 μL Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（200 U·L-1）保溫 70 min；70 ℃保溫15 min、冰上冷卻后得到第一股cDNA。

1.3 Hepcidin原前體肽基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序

參考斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin的全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank：AY834209）設(shè)計(jì)一對(duì)引物，正向引物和反向引物分別為H-F(5'ATGAGGGCAATGAGC ATCGCG 3')和H-R(5'TTAGAACCTGCAGCAGAA CCC 3')，用于擴(kuò)增hepcidin全長(zhǎng)cDNA。以斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟的第一股cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系和條件如下：2.5 μL 第一股 cDNA、各 4.0 μL 10 μmol·L-1的正向和反向引物、1.0 μLTaqplus DNA polymerase（5 U·μL-1）（TaKaRa，Otsu，Japan）、10 μLTaqplus Buffer、8.0 μL dNTP Mixture，用無菌水將反應(yīng)液調(diào)至100 μL；94℃預(yù)變性3 min、94℃變性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸1 min、最終72℃延伸5 min，反應(yīng)共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將該DNA片段經(jīng)DNA純化試劑盒（天根生物科技公司，北京）純化后，作為第二次PCR的模板，設(shè)計(jì)一對(duì)分別含EcoR I和HindIII酶切位點(diǎn)的引物H-MQF(5'CGGAATTCTTACCATCTGAGGTACGGCTC 3')和HMQR(5'CCCAAGCTTTTAGAACCTGCAGCAGAAC CC 3')，用于擴(kuò)增編碼hepcidin原前體肽的cDNA片段。PCR反應(yīng)體系和條件同上，除了退火溫度改為58℃。目的片段“pIH”與pMD19-T simple質(zhì)粒（TaKaRa，Otsu，Japan）按3:1比例、在T4DNA連接酶的作用下，16℃保溫2 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，37℃培養(yǎng)過夜；挑取5個(gè)陽性克隆由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.4 pET32a-pIH重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

上述含“pMD19-pIH”重組質(zhì)粒的陽性克隆經(jīng)LB液體培養(yǎng)過夜后，進(jìn)行質(zhì)粒提純（天根生物科技公司，北京），然后對(duì)其進(jìn)行EcoRI和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，切下目的片段“pIH”進(jìn)行DNA純化。另一方面，對(duì)pET32a（+）表達(dá)質(zhì)粒（Novagen，Darmstadt，Germany）進(jìn)行同樣的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，切下線性質(zhì)粒條帶進(jìn)行DNA純化。將含酶切位點(diǎn)的目的片段“pIH”與線性的pET32a（+）表達(dá)質(zhì)粒按7:1比例、在T4DNA連接酶的作用下，16℃保溫16 h；然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α同上進(jìn)行DNA測(cè)序確證。

1.5 Hepcidin原前體肽的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化

上述含“pET32a-pIH”重組表達(dá)質(zhì)粒的陽性克隆經(jīng)LB液體培養(yǎng)后，進(jìn)行質(zhì)粒提純。5 μL重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌E.coliBL21（DE3），37℃培養(yǎng)過夜；挑選陽性克隆接種于20 mL含氨芐青霉素（100 mg·mL-1）的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0后，按1:50轉(zhuǎn)接到1 000 mL抗性LB培養(yǎng)液中，37℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8；加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37℃、110 r·min-1培養(yǎng)12 h后，將菌液離心10 min（4 ℃，8 000 r·min-1）；用1/10培養(yǎng)液體積的1×PBS緩沖液（pH 7.4）重懸沉淀，冰上進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎后，離心10 min（4 ℃，12 000 r·min-1）；上清液通過Profinia蛋白純化系統(tǒng)（Bio-rad，Laboratories,Inc.,USA），經(jīng)固化金屬離子親和層析(IMAC)純化得到目的“融合蛋白”。

1.6 Tricine-SDS-PAGE分析

Tricine-SDS-PAGE分析參照Schagger的方法[12]。濃縮膠濃度4%，分離膠濃度16%，各樣品的上樣量為20 μL。電泳結(jié)束后用0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色，用25%的甲醇和7%的醋酸混合液脫色。低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白由天根生物科技公司提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin原前體肽的cDNA克隆及其推斷的氨基酸序列

以斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟的第一股cDNA為模板，擴(kuò)增得到編碼hepcidin全長(zhǎng)氨基酸序列的約291 bp的片段（見圖1A）；進(jìn)一步以該片段為模板，根據(jù)巢式PCR的原理，通過設(shè)計(jì)添加EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增得到編碼hepcidin原前體肽（除去信號(hào)肽的氨基酸序列）的約236 bp的片段“pIH”（見圖1B）。由圖2可見，根據(jù)推斷的氨基酸序列，該片段編碼了由72個(gè)氨基酸殘基組成的hepcidin原前體肽（47個(gè)殘基組成的前體肽+25個(gè)殘基組成的成熟肽），且在成熟肽區(qū)域存在8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，它們?cè)诳臻g結(jié)構(gòu)上可形成四對(duì)二硫鍵。本文克隆的編碼原前體肽的cDNA序列與參考序列相比存在2個(gè)核苷酸差異，因而導(dǎo)致前體肽的2個(gè)氨基酸差異。經(jīng)DNA測(cè)序，證明兩個(gè)酶切位點(diǎn)已成功引入該片段（見圖3A）。

2.2 斑點(diǎn)叉尾鮰與其他生物之間的hepcidin原前體肽氨基酸序列比較

圖2顯示斑點(diǎn)叉尾鮰與其他魚類及哺乳動(dòng)物之間的hepcidin原前體肽的氨基酸序列比較。結(jié)果表明，斑點(diǎn)叉尾鮰與長(zhǎng)鰭叉尾鮰、黃顙魚之間的序列同源性分別為96%和72%，與斑馬魚的2個(gè)同工型之間顯示47%～48%的同源性；而與哺乳動(dòng)物之間顯示很低的同源性，只有10%～15%。另一方面，不同生物之間在hepcidin原前體肽的氨基酸序列上存在多個(gè)保守性位點(diǎn)或區(qū)域，其中8個(gè)半胱氨酸殘基是高度保守的，證明它們與hepcidin的抗菌活性密切相關(guān)。

圖1 斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin全長(zhǎng)（A）和原前體肽(B)cDNA的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of cDNAs encoding the full-length hepcidin(A)and prepro-peptide(B)of channel catfish

圖2 斑點(diǎn)叉尾鮰與其他生物之間hepcidin原前體肽的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Comparison of the amino acid sequences for hepcidin prepro-peptides among channel catfish and other species

2.3 “pET32a-pIH”重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將含EcoR I和HindIII酶切位點(diǎn)的“pIH”片段與事先用這兩種酶處理過的pET32a（+）連接，得到重組表達(dá)質(zhì)?！皃ET32a-pIH”（見圖3B）。

在該重組表達(dá)質(zhì)粒中，pET32a（+）所帶的高溶解性的硫氧還蛋白“trxA”的編碼基因與目的片段融合，形成的融合基因有利于高溶解性的融合蛋白的表達(dá)。通過菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)在約824 bp處有清晰條帶（見圖4A），與理論相符，初步確定為陽性菌落；進(jìn)一步對(duì)陽性菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行提純，通過EcoR I和HindIII對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)存在大、小分子質(zhì)量的兩條譜帶，其中一條約219 bp的小分子質(zhì)量譜帶屬于目的片段（見圖4B）。最終通過對(duì)陽性克隆的測(cè)序，證明目的片段“pIH”已正確連接到pET32a(+)表達(dá)載體上，并且核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變。

圖3 克隆的原前體肽序列（A）和重組表達(dá)質(zhì)?！皃ET32a-pIH”構(gòu)建圖（B）Fig.3 Cloned prepro-peptide sequence(A)and construction of recombinant expression plasmid“pET32a-pIH”(B)

圖4 重組表達(dá)表質(zhì)粒的PCR插入檢驗(yàn)（A）和雙酶切鑒定（B）Fig.4 Identification of recombinant expression plasmid by colony PCR(A)and restriction enzyme digestion(B)

2.4 重組hepcidin原前體肽在E.coli BL21(DE3)中的融合表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化

含重組表達(dá)質(zhì)?！皃ET32a-pIH”的工程菌E.coliBL21（DE3）在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)至OD600為0.6～0.8，經(jīng)1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)，在37 ℃培養(yǎng)12 h后，成功表達(dá)了融合蛋白“trxA-pIH”（見圖5，泳道5）。細(xì)胞經(jīng)超聲破碎離心后，對(duì)上清和沉淀（包涵體）進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在于上清（見圖5，泳道6）和沉淀（見圖5，泳道7）中，但前者較后者顯示更深的譜帶；經(jīng)Quantity One software,Version 4.4.0(Bio-Rad,Laboratories,Inc.,USA)對(duì)凝膠進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)融合蛋白的70%以上是可溶的，并且表達(dá)的融合蛋白約占細(xì)胞總蛋白的22.5%。而在陰性對(duì)照組中無任何表達(dá)（見圖5，泳道1-4）。通過IMAC進(jìn)一步對(duì)上清中的含6xHis標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析，可見分子質(zhì)量約為33 ku的融合蛋白“trxA-pIH”的條帶，與預(yù)期的分子質(zhì)量相符（見圖6）。

圖5 在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)的融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.5 Tricine-SDS-PAGE analysis for fusion proteins expressed in E.coli BL21(DE3)

圖6 純化的融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.6 Tricine-SDS-PAGE analysis for the purified fusion protein

3 討論與結(jié)論

通常在肝臟中合成的hepcidin抗菌肽的氨基端含有一段信號(hào)肽，在蛋白質(zhì)翻譯后的修飾中該肽段被蛋白酶切除，剩下包括前體肽和成熟肽的原前體肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液中，再由前體肽轉(zhuǎn)化酶酶切掉前體肽后，形成具有生物活性的小分子成熟肽[18]。因成熟肽僅由20～25個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量較小，可能不利于其在大腸桿菌中的表達(dá)，因此，本文以斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin原前體肽為研究對(duì)象，參考Bao等報(bào)道的斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin全長(zhǎng)cDNA序列[11]，通過RT-PCR從其肝臟克隆到編碼hepcidin原前體肽的cDNA序列。然而，與參考序列相比，該cDNA序列顯示了2個(gè)不同的核苷酸殘基，進(jìn)而導(dǎo)致了原有的纈氨酸和精氨酸由丙氨酸和亮氨酸取代。據(jù)報(bào)道，Hepcidin基因在一些魚類中具有多個(gè)拷貝，例如，黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）含七種hepcidin序列[19]；Huang等從莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)中分離到三種編碼hepcidin 的 cDNA 序列(TH1-5、TH2-2、TH2-3)[20]。因此，本文獲得的hepcidin原前體肽也可能屬于斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin抗菌肽的另外一種同工型。雖然來自不同生物的hepcidin原前體肽之間顯示了在氨基酸序列上的差異，但在它們的成熟肽區(qū)域均存在8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，以致在空間構(gòu)象上形成的4對(duì)二硫鍵決定了hepcidin的抗菌活性[21-22]。

本文選擇pET32a（+）作為表達(dá)質(zhì)粒，它所攜帶的高溶解性的硫氧還蛋白“trxA”的編碼基因與目的片段“pIH”形成的融合基因有利于目的蛋白以高溶解性的融合蛋白的形式表達(dá)。事實(shí)證明，本文在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)的“trxA-pIH”融合蛋白的70%以上是可溶的。通常，由于大腸桿菌細(xì)胞基質(zhì)的還原環(huán)境，使得在大腸桿菌中直接表達(dá)的大部分含半胱氨酸的陽離子抗菌肽是沒有活性的，初步的抑菌試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。進(jìn)一步的研究將關(guān)注于表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性，以使目的蛋白形成正確折疊的三維空間結(jié)構(gòu)而具生物學(xué)活性。嘗試對(duì)于hepcidin成熟肽區(qū)域的重組DNA表達(dá)，也是進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

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