丁香酚在大鼠體內(nèi)的組織分布研究

李婷婷，陳蓉，曾文婷，趙雪，張斌，楊書（.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都60083；.成都市363醫(yī)院藥劑科，成都 60083；3.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，成都 60083）

丁香酚（C10H12O2，4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，分子量為164.20），廣泛存在于丁香油、肉桂葉油、樟腦油等芳香油中，是丁香和丁香羅勒油的主要成分[1]。近年來對(duì)丁香酚的藥理作用和可能的相關(guān)機(jī)制研究都取得了一定進(jìn)展。研究表明，丁香酚具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗過敏、麻醉[2～5]等廣泛的藥理活性。本課題組對(duì)丁香酚在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究，建立了其在大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺的高效液相色譜（HPLC）含量測(cè)定方法，觀察經(jīng)單劑量給藥后在大鼠體內(nèi)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)和主要臟器中的分布經(jīng)時(shí)變化。

1 儀器與材料

1.1 儀器

U-3000 HPLC儀，包括P680型高壓泵、ASI-100型自動(dòng)進(jìn)樣器、UVD170U型多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；CP225D型電子天平（美國(guó)Sartorius公司）；TGL-16型臺(tái)式離心機(jī)（上海市安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A型渦旋混合儀（上海青浦滬西儀器廠）；移液器（20～200 μL，美國(guó)Hamilton公司）。

1.2 試藥

丁香酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：A0074）；肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：A0305，純度≥98%）；甲醇（英國(guó)Dikma公司，批號(hào)：93102）；乙醇（成都市科倫化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20090725）；冰醋酸、氫氧化鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠24只，♂，體重（200±20）g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物使用合格證號(hào)：34動(dòng)管122號(hào)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Allsphere ODS-2 RP-18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%冰醋酸（63∶37，V/V，pH 3.80）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 組織樣品預(yù)處理

取大鼠組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺），于生理鹽水中去除粘連組織，剪碎、稱重后按所取組織重量加入3倍體積的生理鹽水，于玻璃組織勻漿器中勻漿，精密量取大鼠組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺）勻漿液0.5 mL，置于4 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)肉桂酸25 μL，渦旋混勻30 s，混勻后加入甲醇1 mL，繼續(xù)渦旋混勻3 min，12 000 r·min-1離心3 min，取上層清液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，記錄內(nèi)標(biāo)峰面積和丁香酚峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺）中丁香酚的濃度。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丁香酚對(duì)照品適量，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容制備成濃度為68.672 μg·mL-1的貯備液，經(jīng)稀釋，配制成濃度為 0.537、1.074 5、2.167、4.292、8.584、17.168、34.336 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，于0～4 ℃貯藏，備用。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25 mL容量瓶中，制備成濃度為31.80 μg·mL-1的甲醇稀釋液，即得到內(nèi)標(biāo)溶液，于0～4℃貯藏，備用。

2.3.3 丁香酚給藥液的制備 精密稱取丁香酚對(duì)照品適量，加入70%乙醇-聚氧乙烯蓖麻油（1∶1）溶液充分溶解后稀釋，配制濃度為2.26 mg·mL-1的丁香酚給藥溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取大鼠組織樣品勻漿液（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺）0.5 mL，置于離心管中，依次加入不同濃度的丁香酚對(duì)照品溶液25 μL，渦旋混勻30 s，分別得濃度為 2.158、1.078、0.539、0.279、0.139、0.054、0.011 μg·mL-1含藥試樣，按“2.2”項(xiàng)下從“加入內(nèi)標(biāo)肉桂酸”開始操作。測(cè)定組織樣品勻漿中內(nèi)標(biāo)峰面積（Ais）和樣品丁香酚的峰面積（Aa）。以Aa與Ais的比值（A）為縱坐標(biāo)，濃度c（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得大鼠各組織中標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)，詳見表1。

表1 大鼠各組織中標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)Tab 1 Standard curves and correlation coefficients of eugenol in each organ

2.4.2 專屬性試驗(yàn) 取空白胃組織樣品加丁香酚和內(nèi)標(biāo)物肉桂酸，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，各組織中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響，丁香酚的保留時(shí)間約為9.7 min，內(nèi)標(biāo)物肉桂酸的保留時(shí)間約為7.6 min，兩者峰形良好，基線平穩(wěn)。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白胃樣品；B：空白胃樣品+丁香酚（0.279 μg·mL-1）+內(nèi)標(biāo)（0.135 μg·mL-1）；C.給藥后60 min的胃樣品+內(nèi)標(biāo)；1.內(nèi)標(biāo)；2.丁香酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank stomach homogenates；B.blank stomach homogenates+eugenol（0.279 μg·mL-1）+IS（0.135 μg·mL-1）；C.stomach homogenate 60 min after administration+IS；1.IS；2.eugenol

2.4.3 最低定量濃度的確定 配制一系列不同濃度的丁香酚溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定樣品峰面積。結(jié)果表明，丁香酚組織勻漿液濃度在0.011～2.158 μg·mL-1范圍內(nèi)，與峰面積比值呈良好線性關(guān)系，故確定丁香酚組織樣品勻漿液最低定量濃度為 0.011 μg·mL-1。

2.4.4 方法回收率試驗(yàn) 取不同濃度丁香酚對(duì)照品溶液各25 μL，加入0.5 mL空白組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺）勻漿液中，配制高、中、低濃度的含藥組織樣品勻漿液，按“2.2”項(xiàng)下從“加入內(nèi)標(biāo)肉桂酸”開始操作，以測(cè)得值與加入量的比值計(jì)算回收率。結(jié)果，回收率在（83.35±3.37）%～（105.21±5.49）%范圍之間，表明該法可用于測(cè)定大鼠組織中目標(biāo)化合物的濃度。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取丁香酚高、中、低濃度的組織樣品各6份，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，按“2.4.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，以同日內(nèi)5次測(cè)定結(jié)果計(jì)算日內(nèi)精密度，以1周內(nèi)3 d測(cè)定結(jié)果計(jì)算日間精密度。結(jié)果表明，本方法測(cè)定的丁香酚組織樣品的日內(nèi)和日間精密度RSD均＜15%，符合規(guī)定。

2.4.6 絕對(duì)回收率試驗(yàn) 取丁香酚高、中、低濃度的組織樣品各3份，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得樣品中被測(cè)物的色譜峰面積，與相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液中被測(cè)物的色譜峰面積比較，計(jì)算絕對(duì)回收率。結(jié)果，被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)在高、中、低濃度組織樣品中絕對(duì)回收率均＞60%，表明組織樣品的萃取方法穩(wěn)定可靠。

2.4.7 組織樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取丁香酚組織樣品高、低濃度各3份，于（20±2）℃下保存10 h后測(cè)定，考察組織樣品的短期穩(wěn)定性；取組織樣品高、低濃度各3份，制備12 h后測(cè)定，考察組織樣品的制備后穩(wěn)定性；取組織樣品高、低濃度各3份，冷凍貯藏于－20℃，在室溫中充分解凍，然后再次冷凍，重復(fù)3個(gè)凍融周期后測(cè)定，考察組織樣品的3周期凍融穩(wěn)定性。結(jié)果，RSD均＜15%，表明組織中的被測(cè)物穩(wěn)定，其濃度可以被準(zhǔn)確測(cè)定。

2.5 組織分布研究

2.5.1 組織樣品的處理與預(yù)處理 選取SD大鼠，隨機(jī)均分為4組，每組6只，ig丁香酚給藥液，0.25 mL/只。4組大鼠分別于給藥后40 min和2、4、6 h斷頸處死，取出心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、腦、前列腺，稱重，按各組織的重量加入3倍體積的生理鹽水，在玻璃組織勻漿器中分別制成各組織勻漿，所得勻漿液于－20℃貯藏，備用。

2.5.2 組織樣品分布研究 大鼠ig丁香酚后，考察其在心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺組織中不同時(shí)間點(diǎn)的分布經(jīng)時(shí)變化。大鼠各組織中不同時(shí)間點(diǎn)藥物濃度見表2；ig丁香酚后大鼠各組織中待測(cè)化合物的平均藥物濃度分布曲線見圖2。

表2 大鼠各組織中不同時(shí)間點(diǎn)藥物濃度（μg·g-1，±s）Tab 2 The drug concentration of rat tissues at different time points（μg·g-1，±s）

表2 大鼠各組織中不同時(shí)間點(diǎn)藥物濃度（μg·g-1，±s）Tab 2 The drug concentration of rat tissues at different time points（μg·g-1，±s）

組織 時(shí)間點(diǎn)/min心肝脾肺腦腎胃前列腺大腸小腸40 1.990 1±0.072 4 4.792 1±0.154 8 9.973 1±0.312 7 8.920 7±0.413 5 3.232 8±0.117 2 5.536 5±0.183 0 3.790 8±0.099 8 1.200 8±0.058 0 9.591 3±0.428 0 7.381 7±0.207 4 120 2.677 2±0.088 5 9.040 3±0.276 2 12.181 1±0.479 0 11.331 2±0.591 0 3.588 7±0.168 4 10.113 4±0.295 6 9.124 5±0.331 0 1.487 3±0.074 5 13.680 3±0.446 0 13.403 5±0.370 0 240 1.404 1±0.046 5 2.833 0±0.095 7 4.736 9±0.122 6 4.431 7±0.211 2 2.039 8±0.087 5 2.609 5±0.088 4 2.392 9±0.058 0 0.973 1±0.040 4 5.440 8±0.154 7 3.041 2±0.100 9 360 0.823 1±0.033 7 0.516 1±0.019 7 1.061 8±0.032 6 0.932 9±0.041 8 0.467 5±0.018 0 0.575 0±0.016 5 0.915 2±0.025 0 0.332 9±0.017 8 0.690 6±0.014 2 1.422 4±0.057 4

3 討論

圖2 ig丁香酚后大鼠各組織中待測(cè)化合物的平均藥物濃度分布曲線圖（n＝6）Fig 2 Average concentration curves of measured compound in rat tissues after intragastical administration of eugenol（n＝6）

藥物體內(nèi)分布是指藥物從全身循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到各器官、組織的過程。藥物進(jìn)入體循環(huán)后分布于全身各組織，由于器官之間的血液灌注存在差異，藥物與組織結(jié)合力不同等因素的影響，導(dǎo)致藥物分布一般是不均勻的。組織分布研究的重要性不亞于血漿藥物濃度研究，雖然對(duì)人體組織直接測(cè)量藥物的含量存在很大困難，現(xiàn)階段卻可以利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得的數(shù)據(jù)借助數(shù)學(xué)模型推導(dǎo)出在人體內(nèi)的分布參數(shù)，為藥物的有效性和毒副作用作出合理的解釋[6]。

本研究采用ig給藥的方式，初步研究丁香酚在大鼠體內(nèi)心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、大腸、小腸、前列腺中的分布規(guī)律，完善丁香酚藥動(dòng)學(xué)研究。雖然前列腺不是主要的藥物代謝器官，但選擇它是為丁香酚對(duì)前列腺增生的抑制作用的研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。結(jié)果表明，給藥后丁香酚能較快分布到各組織中，分布范圍較廣，其中在腸、脾水平相對(duì)較高，腦中則較低。根據(jù)不同時(shí)間的采樣點(diǎn)所得樣品相互比較，可見120 min采樣點(diǎn)各組織中的丁香酚含量基本都高于其他幾個(gè)采樣點(diǎn)的含量，隨后，采樣時(shí)間越長(zhǎng)，丁香酚含量呈逐漸降低的趨勢(shì)?？傊驹囼?yàn)可為丁香酚的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

[1]陳天麗，張 紅，周春英.丁香外用的臨床及實(shí)驗(yàn)研究慨述[J].山東中醫(yī)雜志，2009，28（2）：139.

[2]馮甲棣，趙書芬，李恒松，等.丁香酚對(duì)正常大鼠視前區(qū)-下丘腦前部溫度敏感神經(jīng)元電活動(dòng)的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，24（2）：115.

[3]金谷大輔著，賀玉琢譯.丁香酚的抗氧化活性[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，2005，27（4）：247.

[4]禾 軍，馮甲棣，肇 暉，等.丁香酚對(duì)豚鼠弓狀核溫度敏感神經(jīng)元電活動(dòng)的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，28（1）：13.

[5]彭宅彪，張瓊光，代虹健，等.丁香酚的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥.2006，17（10）：2 079.

[6]陳 鋒，袁 媛，李澤有，等.黃酮類化合物組織分布研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2007，18（30）：2 379.