江南卷柏中的黃酮碳苷類成分研究Δ

朱田密，陳科力，黎莉（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)省部共建中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430065；2.湖北省中醫(yī)院藥事部，武漢 430061；3.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，武漢 430073）

江南卷柏（Selaginella moellendorffiiHieron.）是卷柏科卷柏屬藥用植物，多年生草本，具有清熱利濕、止血之功效[1]。已知其化學(xué)成分有異茴芹素、銀杏素等[2，3]。卷柏屬含有豐富的雙黃酮類化合物，而黃酮碳苷很少報(bào)道，史社坡[4]2003年首先從卷柏中得到了芹菜素-6，8-二-C-β-葡萄糖苷；筆者于2008年在碩士學(xué)位論文中報(bào)道在江南卷柏中發(fā)現(xiàn)了4種黃酮碳苷[5]；申健2010年的碩士學(xué)位論文中亦報(bào)道從布朗卷柏中分離得到了芹菜素6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷以及芹菜素6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷[6]。本文詳細(xì)報(bào)道3種黃酮碳苷的提取分離方法和結(jié)構(gòu)鑒定過程。

1 儀器與試藥

INOVA600核磁共振儀（美國Varian公司）；7.0T傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（美國IonSpec公司）；U-2001紫外分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；5700FFIR紅外分光光度計(jì)（美國Nicolet公司）；P680高效液相色譜儀（美國Dionex公司）。

江南卷柏全草于2005年7月采自湖北恩施，由湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為江南卷柏Selaginella moellendorffiiHieron.，標(biāo)本留存于湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心。聚酰胺粉（60～100目，武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司）；Sephadex LH-20（瑞士Pharmacia公司）；聚酰胺薄膜（20×20 cm，浙江臺(tái)州路橋四青生化材料廠）；薄層色譜硅膠G（青島海洋化工廠）；其他試劑均為分析純。

2 提取與分離

江南卷柏干燥全草12 kg，切段，依次用15倍量95%、90%、80%乙醇各提取3 h，濾過，減壓回收乙醇，濃縮成浸膏，用蒸餾水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，得到正丁醇部位浸膏120 g。取正丁醇部位浸膏113 g，上樣于聚酰胺柱（60～100目，86 cm×9 cm），以不同濃度的水-乙醇梯度洗脫，每500 mL為一流分，共收集279份流分，用硅膠G薄層和聚酰胺薄膜檢識(shí)，合并相同流分，得28個(gè)部分（Fr1～Fr28）。取Fr6（純水洗脫部分）、Fr7（5%乙醇洗脫部分）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（甲醇，60 cm×2.2 cm）純化，流分結(jié)晶后得化合物Ⅰ（40 mg）；采用相同方法，F(xiàn)r9（10%～15%乙醇洗脫部分）純化得復(fù)合結(jié)晶Ⅱ和Ⅲ（16 mg）。此外，F(xiàn)r8（10%乙醇洗脫部分）和Fr10（15%乙醇洗脫部分）經(jīng)過Sephadex LH-20柱色譜后，再用半制備高效液相色譜分離，亦得到復(fù)合結(jié)晶Ⅱ和Ⅲ（10mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：淡黃色粉末（甲醇），UV（MeOH）λmax：272、333 nm；IR（KBr）νmax：3 383（br，OH）、2 927（CH2）、1 651（Ar-C＝O）、1 626、1 574、1 511、1 481（芳環(huán)骨架振動(dòng)）、829（苯環(huán)對(duì)位二取代）cm－1；HR ESI-MS（m/z595.1 657[M+H]+，計(jì)算值595.1 663）推斷分子式為C27H30O15（Ω＝13）。三氯化鐵反應(yīng)陽性，噴三氯化鋁顯色劑于紫外光燈下顯黃色熒光，提示可能為黃酮類化合物；氨氣熏后黃色熒光不變亮，為黃酮苷；常規(guī)酸水解條件下不能被水解，表明為碳苷。其核磁共振氫譜（1H-NMR，DMSO-d6，600 MHz）見表1；核磁共振碳譜（13C-NMR，DMSO-d6，150 MHz）見表2。δC低于140的碳原子數(shù)有6個(gè)，說明黃酮母核除C-2、C-4、C-9外，還有3個(gè)碳原子連有氧原子，這和1H-NMR中顯示3個(gè)-OH信號(hào)相符。糖基碳原子δ低至81，是碳苷的表現(xiàn)。HSQC中δC73.9、73.2分別與δH4.81（1H，d，J＝10.8 Hz）、4.76（1H，d，J＝10.2 Hz）相關(guān)，是2個(gè)碳苷端基C、H信號(hào)。根據(jù)13C-NMR中的12個(gè)糖碳信號(hào)，DEPT譜δC59.7、61.2顯示的2個(gè)CH2，1H-NMR中糖基所有氫原子的偶合常數(shù)JH-H值都大于5Hz以及2個(gè)端基氫的偶合常數(shù)（J＝10.8 Hz，10.2 Hz），說明2個(gè)糖單元都為β-D-吡喃葡萄糖，并且各自連在母核上。HMBC中端基H-1″與母核C-5、C-6、C-7遠(yuǎn)程相關(guān)，端基H-1′″與母核C-7、C-8、C-9遠(yuǎn)程相關(guān)，表明2個(gè)糖基分別連在母核C-6和C-8位；另有遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)確定了3個(gè)-OH取代位置在母核C-5、C-7、C-4′位。綜合上述分析，并與文獻(xiàn)對(duì)照[7]，確定其為芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷。

復(fù)合物Ⅱ和Ⅲ：黃色粒狀結(jié)晶（甲醇），UV（MeOH）λmax：272、330 nm；三氯化鐵反應(yīng)陽性，三氯化鋁反應(yīng)紫外光燈下顯黃色熒光，提示可能為黃酮類化合物；其1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）見表1；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）見表2。糖基碳原子δC低至81，表明為碳苷。δC59～81有22個(gè)C信號(hào)（δC70.3為重疊），表明有4個(gè)糖基（2個(gè)六碳糖和2個(gè)五碳糖）。HMQC可確定4個(gè)端基C-H：δC75.2、73.6、74.9、73.9分別與δH5.02（1H，d，J＝9.0 Hz）、4.74（1H，d，J＝9.6 Hz）、4.65（1H，d，J＝9.0 Hz）、4.55（1H，d，J＝9.6 Hz）相關(guān)。4個(gè)端基碳都處于較高場δC73～75，說明4個(gè)糖基與母核以碳鍵相連，為碳苷。端基氫的偶合常數(shù)（J＝9.0 Hz，9.6 Hz）說明4個(gè)糖基都是β構(gòu)型；DEPT譜顯示 4 個(gè)CH2：δC59.7、61.2、70.3（2個(gè)CH2疊加），1H-NMR（600 MHz）任意2個(gè)H的JH-H值都不小于3 Hz，以及表2數(shù)據(jù)表明4個(gè)糖基為2個(gè)β-D-吡喃葡萄糖和2個(gè)β-D-吡喃木糖[8～10]。母核碳信號(hào)個(gè)數(shù)為24（部分重疊），大于15，且多數(shù)信號(hào)成對(duì)出現(xiàn)，提示分子中可能含有2個(gè)黃酮單元，或者是2個(gè)化合物的復(fù)合物。據(jù)HMBC糖端基H與母核C-6、C-8位的遠(yuǎn)程相關(guān)，確定了4個(gè)糖基分別連在母核上的6，8位；結(jié)合HMQC，1H-NMR確定了C-5、C-7、C-4′位有-OH取代，C-3位有H。因所有位置均有歸屬，2個(gè)黃酮單元無處相連，判斷其為一對(duì)同分異構(gòu)體復(fù)合物。這個(gè)判斷經(jīng)質(zhì)譜得到了證實(shí)：HR ESI-MS在300～1 300分子量范圍內(nèi)只顯示一個(gè)準(zhǔn)分子離子峰（m/z563.1 395[M-H]－，計(jì)算值563.1 401），證實(shí)了該晶體是一對(duì)分子式為C26H28O14（Ω＝13）的同分異構(gòu)體，確定其為芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-吡喃木糖苷和芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷的復(fù)合物?；衔锝Y(jié)構(gòu)式及HMBC相關(guān)性表達(dá)見圖1。

表 1化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的 1H-NMR 數(shù)據(jù)（600 MHz，（J）HzDMSO-d6）Tab 1 1H-NMR data of compoundⅠ、Ⅱ、Ⅲ（600 MHz，（J）Hz，DMSO-d6）

表2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的13C-NMR數(shù)據(jù)（150 MHz，DMSO-d6）Tab 2 13C-NMR data of compoundⅠ、Ⅱ、Ⅲ（150 MHz，DMSO-d6）

4 化合物抑制環(huán)氧化酶（COX-2）活性測試

圖1 化合物結(jié)構(gòu)式及HMBC相關(guān)性表達(dá)Ⅰ.芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷；Ⅱ.芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-吡喃木糖苷；Ⅲ.芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷Fig 1 Structures and key correlations for compoundsⅠ.6，8-di-C-β-D-glucopyranosylapigenin；Ⅱ.6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranosylapigenin；Ⅲ.6-C-β-D-xylopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranosylapigenin

選擇化合物Ⅰ進(jìn)行抑制COX-2的活性測試。參照文獻(xiàn)方法[11]，將化合物Ⅰ作用于培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29），配成不同濃度的試驗(yàn)組（終濃度分別為12.5、25.0、50.0 μg·mL－1），同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、陽性對(duì)照姜黃素組（3.125 μg·mL－1）做對(duì)比，繼續(xù)培養(yǎng)，提取總RNA。采用RT-PCR技術(shù)檢測藥物作用前、后HT-29細(xì)胞中COX-2 mRNA的表達(dá)，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖2。以灰度值即COX-2 275bp電泳帶與內(nèi)參β-actin 234 bp電泳帶的吸光度值的比值來反映COX-2 mRNA的相對(duì)含量（計(jì)算公式：COX-2 mRNA灰度值＝COX-2 mRNA密度/β-actin mRNA密度）（見表3）。結(jié)果，樣品組的灰度值與其濃度之間呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.944，說明化合物Ⅰ可在mRNA水平抑制HT-29COX-2的表達(dá)。

圖2 電泳圖M.DL2000 DNA Marker；1.空白對(duì)照組；2.陽性對(duì)照姜黃素 3.125 μg·mL－1；3.化合物Ⅰ 12.5 μg·mL－1；4.化合物Ⅰ 25.0 μg·mL－1；5.化合物Ⅰ50.0 μg·mL－1Fig 2 ElectrophoretogramM.DL2000 DNA Marker；1.blank control group；2.curcumin positive control 3.125 μg·mL－1；3.compoundⅠ 12.5 μg·mL－1；4.compoundⅠ25.0 μg·mL－1；5.compoundⅠ 50.0 μg·mL－1

表3 灰度值測定結(jié)果Tab 3 Results of gray scale determination

5 討論

除以上3種黃酮碳苷外，筆者還從江南卷柏正丁醇部位分離鑒定了一個(gè)新的黃酮氧苷：系由上述聚酰胺柱色譜40%乙醇洗脫部分，經(jīng)Sephadex LH-20柱（甲醇）純化、結(jié)晶而得（51 mg），經(jīng)理化性質(zhì)和波譜分析，鑒定為5-羧甲基-4′-羥基-黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，是首次發(fā)現(xiàn)的5-羧甲基取代的黃酮類型，這一研究發(fā)表在Chinese Chemical Letters[12]；之后，這一黃酮類型又有新發(fā)現(xiàn)：Cao Y[13]等2010年從江南卷柏、申健[6]從布朗卷柏中分別發(fā)現(xiàn)了新化合物：5-羧甲基-4′，7-二羥基黃酮，Cao Y等[13]還得到了它的乙酯和丁酯，也是2個(gè)新化合物并具抗乙型肝炎病毒活性。申健[6]還分離得到了與江南卷柏相同的成分：4′-羥基-5-羧甲基黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。至此，卷柏屬中已報(bào)道了4種5-羧甲基取代的黃酮類化合物。

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