大黃素固體脂質(zhì)納米粒在小鼠體內(nèi)的組織分布研究

張 洪，閆士君，張福明（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060）

大黃素（EMO）是我國傳統(tǒng)中藥大黃的主要有效成分，其化學(xué)名為1，3，8-三羥基-6甲基蒽醌（1，3，6-trihydroxy-6methy lanthraquinone），分子量為270.23。目前國內(nèi)、外很多學(xué)者對其作了深入研究，發(fā)現(xiàn)具有廣泛的藥理作用，不僅具有抗炎、調(diào)節(jié)脂代謝、保護(hù)肝腎功能，而且對肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤具有明顯的抑制作用[1，2]。

固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是20世紀(jì)末期興起的一種新型納米載藥系統(tǒng)，不僅具備物理穩(wěn)定性高、良好靶向性和能增加藥物穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，還具有脂質(zhì)體毒性低、可大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢[3，4]，近年來已成為藥劑學(xué)科中的研究熱點(diǎn)。筆者采用實(shí)驗(yàn)室制備好的大黃素固體脂質(zhì)納米粒（EMO-SLN），通過iv給藥，研究其在小鼠體內(nèi)的組織分布特點(diǎn)，進(jìn)行EMO-SLN的靶向性探討，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

P680型分析型高效液相色譜（HPLC）儀（美國戴安公司）；XW-80型渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；3K30型冷凍高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；BF2000型水浴氮?dú)鈸]干儀（北京八方實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；AG245型電子天平（德國Mettler Toledo公司）；玻璃勻漿器（武漢凱博儀器公司）。

1.2 試藥

EMO原料藥（寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司，批號：080726）；EMO對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：0753-8902）；EMO-SLN（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部自制）；肝素鈉注射液（天津市生物化學(xué)制藥廠）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠132只，♀♂兼半，體重（200±20）g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（鄂）2004-002）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取EMO對照品3 mg，用甲醇定容至100 mL，配成濃度為30 μg·mL-1的溶液，從中精密量取1、2、5、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，精密量取此溶液2、5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成濃度分別為0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、15.0 μg·mL-1的系列對照品溶液。

2.2 生物樣品的采集和處理

取健康小鼠60只，隨機(jī)分成2組，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，分別iv EMO對照品溶液和EMO-SLN混懸（劑量均為10 mg·kg-1），于給藥后0.083、0.250、0.500、1.000、2.000、6.000 h脫臼處死小鼠，取小鼠心、肝、脾、肺、腎各組織樣品，用生理鹽水沖凈表面血液和內(nèi)容物后，精密稱定，加入2倍量的生理鹽水研磨成勻漿。精密量取血漿或勻漿100 μL，置于5 mL的離心管中，加入30%H2SO4100 μL，渦旋混合30 s，70 ℃水浴30 min，水解30 min，冷卻至室溫。加入乙醚1 mL，渦旋混合提取3 min，3 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至5 mL離心管中。下層水相依法用乙醚萃取1次，合并乙醚液，于40℃氮?dú)庀麓蹈桑瑲堄辔镉?00 μL 甲醇溶解，渦旋混合 3 min，12 000 r·min-1離心 10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖和峰面積。

2.3 EMO小鼠體內(nèi)分析方法的建立

2.3.1 色譜條件[5]色譜柱：ASM-Kromasil-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（90∶10）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃。

2.3.2 方法的專屬性試驗(yàn) 取空白血漿和組織勻漿給藥后收集的血漿和勻漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，照上述色譜條件進(jìn)樣20 μL，測定。結(jié)果表明，在選定的條件下，EMO與內(nèi)源性物質(zhì)分離良好，且在樣品處理過程中未引入干擾性物質(zhì)，方法的專屬性良好。小鼠組織勻漿樣品的HPLC見圖1。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿或空白組織勻漿100 μL，置于5 mL離心管中，加系列對照品溶液使之成為相當(dāng)于血漿或組織勻漿濃度0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、15.0 μg·mL-1的樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法操作。以待測物濃度（c）為橫坐標(biāo)，對照品峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得血漿和各組織勻漿的回歸方程。結(jié)果表明，EMO檢測濃度在0.3～15.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。EMO在小鼠組織勻漿和血漿中的回歸方程見表1。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 分別取空白血漿和組織勻漿100 μL，加入不同濃度EMO對照品溶液，渦旋混合3 min，制成高、中、低濃度EMO血漿樣品，各濃度制備3個(gè)樣本，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)各重復(fù)5次，計(jì)算精密度。結(jié)果，日內(nèi)、日間精密度的RSD均＜15%，符合生物樣品分析要求。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.5 方法回收率試驗(yàn) 精密吸取適量3種濃度的EMO對照品溶液，加到100 μL空白血漿和組織勻漿中，渦旋混合3 min，制成高、中、低濃度生物樣品，每一濃度分別制備3個(gè)樣本。按“2.2”項(xiàng)下方法操作，記錄峰面積，將其代入回歸方程計(jì)算測得的濃度，以測得濃度與實(shí)際加入濃度之比計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表3。

2.3.6 提取回收率試驗(yàn) 精密吸取適量的3種濃度的EMO對照品溶液適量，加到100 μL空白血漿和組織勻漿中，渦旋混合3 min，制成高、中、低濃度的血漿樣品，每一濃度分別制備3個(gè)樣本。按“2.2”項(xiàng)下方法操作，記錄樣品峰面積，將樣品峰面積與空白峰面積相除即得提取回收率，結(jié)果見表4。

由表3、表4可知，RSD均＜15%，方法重現(xiàn)性較好。說明所采用的分析方法符合生物樣品分析要求，可用于提取小鼠組織和血漿樣品中EMO。

2.4 實(shí)驗(yàn)方案

2.4.1 小鼠體內(nèi)組織分布實(shí)驗(yàn) 將72只昆明種小鼠隨機(jī)分成對照組與制劑組，每組再分成6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。以用EMO對照品溶液的一組作為對照組，用EMO-SLN混懸液為制劑組。禁食12 h后，尾iv給藥，劑量為10 mg·kg-1。分別于給藥后0.083、0.250、0.500、1.000、2.000、6.000 h摘眼球取血，加肝素抗凝，4 000 r·min-1離心10 min分離血漿，然后將小鼠頸椎脫臼處死，迅速取出心、肝、脾、肺、腎，用生理鹽水洗凈各組織表面的殘血，并用濾紙將水分吸干，于－20℃下貯藏，待用[6]。

取100 μL小鼠組織勻漿和血漿，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測定不同時(shí)間點(diǎn)尾ivEMO對照品溶液和EMO-SLN混懸液后，小鼠血漿和各組織中的EMO濃度。小鼠尾iv EMO對照品溶液和EMO-SLN混懸液后的藥物濃度比較見表5（表中a為EMO對照品溶液；b為EMO-SLN混懸液）。

2.4.2 小鼠體內(nèi)單點(diǎn)濃度的橫向比較 為了直觀地比較小鼠尾iv EMO對照品溶液和EMO-SLN混懸液后EMO在不同組織中的分布情況，以尾iv 0.250 h后為例繪制小鼠各組織中EMO平均濃度直方圖。小鼠尾iv EMO對照品溶液和EMOSLN混懸液0.25 h的組織分布見圖2。

由圖2可知，小鼠iv EMO-SLN混懸液和EMO對照品溶液后，藥物在肝臟中的濃度最高，其次是血漿、肺和心，而在脾、腎中濃度最低。為進(jìn)一步說明EMO-SLN混懸液對EMO在小鼠體內(nèi)分布的改變特征，筆者還對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了定量處理，利用3p97軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬和，通過軟件得出各組織的AUC。

圖1 小鼠組織勻漿樣品的HPLC圖A1.心空白勻漿；A2.注射EMO-SLN后心勻漿樣品；B1.肝空白勻漿；B2.注射EMO-SLN后肝勻漿樣品；C1.脾空白勻漿；C2.注射EMO-SLN后脾勻漿樣品；D1.肺空白勻漿；D2.注射EMO-SLN后肺勻漿樣品；E1.腎空白勻漿；E2.注射EMO-SLN后腎勻漿樣品；F1.空白血漿；F2.注射EMO-SLN后血漿樣品Fig 1 HPLC chromatograms of EMO in homogenate sample of mouse tissnesA1.heart blank homogenate；A2.heart homogenate sample after EMOSLN injection；B1.liver blank homogenate；B2.liver homogenate sample after EMO-SLN injection；C1.spleen blank homogenate；C2.spleen homogenate sample after EMO-SLN injection；D1.lung blank homogenate；D2.lung homogenate sample after EMO-SLN injection；E1.kidney blank homogenate；E2.kidney homogenate sample after EMO-SLN injection；F1.blank plasma；F2.plasma sample after EMO-SLN injection

表1 EMO在小鼠組織勻漿和血漿中的回歸方程Tab 1 Regression equation of EMO in different mouse tissue homogenates and plasma

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of precision test（n＝3）

表3 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of methodology recovery test

表4 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of extraction recovery test

表5 小鼠尾iv EMO對照品溶液和EMO-SLN混懸液后的藥物濃度比較Tab 5 Comparison of the concentrations of EMO after i.v.injection of EMO control solution and EMO-SLN suspension in mice

圖2 小鼠尾iv EMO對照品溶液和EMO-SLN混懸液0.25 h的組織分布圖Fig 2 Tissue distribution of EMO 0.25 h after i.v.injection of EMO control solution and EMO-SLN suspension in mice

2.4.3 EMO-SLN混懸液靶向性評價(jià) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，綜合選用靶向性參數(shù)：總靶向效率攝取率（re）、總靶向性（Te）來進(jìn)行評價(jià)。其中：re＝AUCn/AUCs，Te＝AUC靶/AUC總，式中n和s分別表示混懸液和溶液。EMO對照品溶液、EMO-SLN混懸液的靶向性參數(shù)比較結(jié)果見表6。

表6 EMO對照品溶液、EMO-SLN混懸液的靶向性參數(shù)比較結(jié)果Tab 6 Comparison of target parameters of EMO control solution and EMO-SLN suspension

由表6可知，小鼠尾iv EMO-SLN混懸液后，肝臟和脾臟的re分別是4.139和2.194，肝臟的Te也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它各器官，達(dá)到了57.99%，這說明小鼠經(jīng)尾iv EMO-SLN混懸液后，其肝臟靶向明顯，藥物濃集于肝臟中。

3 討論

SLN的體內(nèi)分析方法很多，本文采用HPLC法測定EMO在組織的分布，簡單可行，在所選用的色譜條件下，樣品內(nèi)源性物質(zhì)不干擾EMO的測定，測定結(jié)果較好。將EMO制成SLN后改變了其在小鼠組織的分布，肝臟的靶向性明顯增強(qiáng)，肝臟re和總靶向性都明顯增強(qiáng)。這使其有望用于肝癌、肝纖維化的治療。

本研究中渦旋提取是很重要的步驟，生物樣本的提取中出現(xiàn)了多次渦旋過程。組織勻漿樣本比血漿樣品黏稠，為了提高渦旋效率，提高提取回收率，故選用了功率較大的渦旋儀，渦旋較長時(shí)間，盡可能使其混合均勻，使液-液萃取的效率提高。

從小鼠體內(nèi)分布研究可以看出，小鼠尾iv給予相同劑量的EMO對照品溶液和EMO-SLN混懸液后不同時(shí)間里，藥物在血漿、心、肝、脾、肺、腎分布呈現(xiàn)出不同程度的差異。通過比較各器官的re、Te可知，EMO-SLN在肝臟、脾臟的濃度最高。

本研究表明，與EMO對照品溶液比較，EMO-SLN混懸液可在組織中較長時(shí)間保持較高濃度，消除較慢，更利于維持穩(wěn)態(tài)血藥濃度。

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