哮喘小鼠CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞和Foxp3蛋白的變化及淫羊藿苷干預(yù)作用①

金華良 羅清莉 厲 蓓 吳金峰 呂玉寶 杜文靜 徐海林 王根發(fā) 王 鎵 董競(jìng)成

(復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海200040)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是氣道的一種慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病，氣道高反應(yīng)是其顯著特征，氣道炎癥學(xué)說(shuō)則是近年來(lái)公認(rèn)最重要的發(fā)病機(jī)制之一。Th1/Th2失衡理論在哮喘氣道炎癥的作用已被廣泛認(rèn)同［1］。但哮喘的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，并不能完全用此理論來(lái)解釋。Thl細(xì)胞并不一定起到保護(hù)性作用，有研究發(fā)現(xiàn)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ可作用于肥大細(xì)胞上相應(yīng)受體，加重氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥［2］。近年來(lái)研究認(rèn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(簡(jiǎn)稱Treg細(xì)胞)在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)及抑制炎癥方面起著重要作用，與哮喘氣道炎癥密切相關(guān)。Treg細(xì)胞可顯著抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活化和增殖，減少促炎因子的合成及降低IgE水平，從而減輕哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性［3，4］。CD4+CD25+Foxp3+是研究較為成熟的Treg細(xì)胞表型標(biāo)記，F(xiàn)oxp3是其最特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Treg細(xì)胞分化成熟和功能的發(fā)揮具有重要意義［5］。但對(duì)于哮喘發(fā)病中 Treg細(xì)胞比例及Foxp3蛋白含量的變化，目前尚未完全闡述清楚。

本課題組既往研究證實(shí)補(bǔ)腎中藥淫羊藿可通過(guò)改善下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，促進(jìn)內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素釋放，從而控制哮喘氣道炎癥［6，7］。淫羊藿苷是淫羊藿主要的有效成分，我們前期研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以有效抑制哮喘模型氣道炎癥［8］。但淫羊藿苷是否對(duì)Treg細(xì)胞及Foxp3蛋白有調(diào)節(jié)作用，從而抑制氣道炎癥，目前尚未了解。本研究通過(guò)檢測(cè)哮喘模型氣道炎癥水平及氣道高反應(yīng)性，脾臟Treg細(xì)胞比例和Foxp3平均熒光強(qiáng)度，以及肺組織Foxp3蛋白表達(dá)量的變化，并觀察淫羊藿苷的干預(yù)作用，探討淫羊藿苷對(duì)哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康6周齡BALB/c小鼠32只(體重16～18克)，上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、哮喘模型組、淫羊藿苷組和地塞米松組，每組8只。淫羊藿苷，由成都曼斯特生物科技有限公司提供;地塞米松，由西安博森生物制藥有限責(zé)任公司提供。卵蛋白(Ⅱ級(jí))、氫氧化鋁和乙酰甲膽堿:均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;小鼠調(diào)節(jié)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(Mouse Regulatory T Cell Staining Kit#1)，及大鼠抗小鼠Foxp3單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó) ebioscience(San Diego，USA)公司;IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定試劑盒:購(gòu)于上海西塘生物醫(yī)藥公司;小鼠有創(chuàng)肺功能儀:美國(guó)buxco公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀:美國(guó)BD公司產(chǎn)品;超聲霧化器:上海魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品，型號(hào):402AI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備 造模方法參照文獻(xiàn)并加以改進(jìn)［9］。哮喘組:于實(shí)驗(yàn)第0天和第14天腹腔內(nèi)注射致敏液0.5 ml(含卵蛋白100μg和氫氧化鋁干粉5 mg)，第21天起用1%的卵蛋白生理鹽水溶液霧化吸入激發(fā)，隔天1次，每次30分鐘，連續(xù)2周。淫羊藿苷和地塞米松治療組:哮喘小鼠動(dòng)物模型的建立同哮喘組，并從第21天起于每次激發(fā)前1小時(shí)灌胃給藥，分別給予淫羊藿苷組50 mg/kg，地塞米松1 mg/kg，每天1次，連續(xù)2周至處死。正常對(duì)照組:用等量生理鹽水代替卵蛋白進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入。

1.2.2 氣道高反應(yīng)性檢測(cè) 通過(guò)Buxco公司有創(chuàng)肺功能儀直接測(cè)定氣道阻力(airway resistance，RL)反映小鼠的氣道反應(yīng)性。小鼠在末次激發(fā)24小時(shí)后，腹腔注射戊巴比妥鈉70 mg/kg麻醉。將麻醉后的小鼠行氣管切開(kāi)術(shù)后插管，放入密閉體描箱內(nèi)，呼吸機(jī)輔助通氣。等小鼠氣道阻力基線穩(wěn)定后，測(cè)定10μl倍增濃度的乙酰甲膽堿霧化激發(fā)后小鼠RL的變化，每次霧化10秒，記錄3分鐘。激發(fā)濃度由低到高，依次為 0、3.12、6.25、12.5 mg/ml。以各濃度RL原始值變化來(lái)評(píng)估小鼠氣道反應(yīng)性。

1.2.3 血清、肺泡灌洗液(BALF)采集和IL-10測(cè)定 采用摘眼球取血，放于無(wú)菌離心管中，然后在常溫下靜置2小時(shí)后，4℃，3 000 r/min，離心10分鐘，收集上部血清，棄沉淀，-80℃保存。BALF收集通過(guò)夾閉右主支氣管，用相應(yīng)導(dǎo)管插入左主氣管內(nèi)，緩緩注入0.5ml生理鹽水，反復(fù)灌洗左肺3次，回收率在80%左右。將回收的BALF在4℃，3 000 r/min下，離心10分鐘，上清液保存于 -80℃。血清和BALF上清液IL-10的測(cè)定采用ELISA法，檢測(cè)過(guò)程按生產(chǎn)廠商提供的操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.4 肺組織HE染色 取右肺上葉，10%的中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，厚4μm，行蘇木精-尹紅(HE)染色，光鏡下觀察小鼠支氣管粘膜下和周?chē)谓M織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。參照文獻(xiàn)［10］，對(duì)炎癥浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)分:0，沒(méi)有炎癥細(xì)胞;1，少量炎癥細(xì)胞;2，炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚為1個(gè)細(xì)胞;3，炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚為2～4個(gè)細(xì)胞;4，炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚＞4個(gè)細(xì)胞。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 無(wú)菌取脾，用彎剪將脾臟剪成小塊，加入1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液分離后取白霧層，洗滌，1 500 r/min，5分鐘離心沉淀后PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，配成每EP管1×106個(gè)細(xì)胞，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記單抗(anti-CD4-FITC、anti-CD25-APC)，輕輕混勻，冰上避光孵育30分鐘。用流式細(xì)胞染色緩沖液洗滌后，加入1 ml細(xì)胞固定和破膜液，冰上避光孵育30分鐘。破膜緩沖液洗滌2次，加入anti-Foxp3-PE，冰上避光孵育60分鐘，用破膜緩沖液洗滌2次，300μl PBS重懸。以上操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析:采用Flowjo軟件，計(jì)算CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在脾臟淋巴細(xì)胞中的百分率，以及Treg細(xì)胞Foxp3平均熒光強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 取肺組織提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組取50μg的總蛋白，按1∶4加入5×SDS上樣緩沖液，沸水浴中加熱5分鐘，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉1小時(shí)，分別加入 Foxp3(1∶250)和內(nèi)參 GAPDH(1∶1 000)一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫與膜孵育1小時(shí)，TBST洗滌3次，ECL法曝光后洗片，掃描后用Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行光密度計(jì)算，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)量指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Dunnett法，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 氣道高反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Measurement of airway hyperresponsiveness

2 結(jié)果

2.1 氣道反應(yīng)性測(cè)定 各組小鼠的基礎(chǔ)RL無(wú)顯著差異，乙酰甲膽堿以3.125 mg/ml劑量激發(fā)時(shí)各組比較氣道阻力(RL)無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。乙酰甲膽堿以6.25和12.5 mg/ml劑量激發(fā)時(shí)，與正常組比較:哮喘模型組RL顯著升高(P ＜0.05);與模型組比較:淫羊藿苷及地塞米松組RL均顯著降低(P ＜ 0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 肺組織病理結(jié)果 正常對(duì)照組支氣管管腔光滑，氣道黏膜無(wú)明顯水腫，肺泡間隔正常，氣道及肺泡見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);哮喘模型組可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，氣道平滑肌增生變厚;地塞米松組及淫羊藿苷組氣道壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯降低。與正常組比較:模型組氣道炎癥評(píng)分顯著升高(P ＜0.05);與模型組比較，淫羊藿苷組及地塞米松組氣道炎癥評(píng)分顯著減輕(P ＜0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 脾CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及Foxp3平均熒光強(qiáng)度 與正常組比較:模型組脾CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但 Foxp3平均熒光強(qiáng)度顯著下降(P＜0.05);與模型組比較:地塞米松及淫羊藿苷組脾CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異(P＞0.05)，地塞米松組Foxp3平均熒光強(qiáng)度顯著升高(P＜0.05)，淫羊藿苷組較模型組無(wú)顯著差異(P ＞ 0.05)，見(jiàn)表1和圖3。

圖2 各組肺組織病理變化(HE染色，×100倍)及炎癥評(píng)分Fig.2 Histological analysis by HE staining( ×100)and airway inflammation score

表1 各組脾Treg細(xì)胞比例(%，±s)Tab.1 Frequencies of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in spleen detected by FCM(%±s)

表1 各組脾Treg細(xì)胞比例(%，±s)Tab.1 Frequencies of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in spleen detected by FCM(%±s)

Note:Vs asthma group，1)P ＜0.05.

Groups Treg MFI(Foxp3)Normal 8.05 ±1.14 73.03 ±11.411)Asthma 8.52 ±0.92 54.4 ±5.05 Icariin 9.25 ±0.98 63 ±5.51 DEX 9.76 ±1.64 70.08 ±14.001)

圖3 各組Treg細(xì)胞流式檢測(cè)圖Fig.3 Representative plots of FCM are from a single rat in each group

2.4 肺組織中Foxp3的蛋白含量 Westem blot結(jié)果顯示，與正常組比較:哮喘組肺組織Foxp3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);與模型組比較，淫羊藿苷組和地塞米松組Foxp3表達(dá)量均顯著升高(P ＜ 0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5 肺泡灌洗液及血清IL-10 各組肺泡盥洗液(BALF)IL-10無(wú)明顯差異(P＞0.05);與正常組比較:模型組血清IL-10顯著下降;與模型組比較:淫羊藿苷組及地塞米松組血清IL-10水平均顯著升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

圖4 Foxp3的蛋白在肺組織中的Western blot檢測(cè)Fig.4 The expression of Foxp3 protein in lung tissues by Western blot

表2 BALF及血清IL-10水平(%，x±s)Tab.2 The levels of IL-10 in BALF and serum(%，x±s)

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哮喘脾Treg細(xì)胞比例與正常組無(wú)顯著差異，這與既往報(bào)道類似［11］。有研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血CD4+CD25high和CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞比例較正常人群無(wú)顯著差異［12］。這提示哮喘肺外組織Treg細(xì)胞比例可能無(wú)顯著變化。本實(shí)驗(yàn)未測(cè)肺組織或BALF中Treg細(xì)胞比例，是局限所在。但既往已證實(shí)哮喘小鼠肺組織Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量增加，相對(duì)比例較正常組顯著下降［13］。而臨床研究則發(fā)現(xiàn)輕度哮喘患者其BALF中Treg細(xì)胞數(shù)量與正常人群無(wú)顯著差異，當(dāng)哮喘急性發(fā)作后，BALF中Treg細(xì)胞數(shù)量顯著升高，但外周血Treg細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著變化［14］，這說(shuō)明哮喘Treg細(xì)胞比例或數(shù)量與所檢測(cè)部位以及哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

Treg細(xì)胞分化成熟過(guò)程和功能很大程度上與轉(zhuǎn)錄因子Foxp3相關(guān)，減少或移除Foxp3可導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能下降，而Foxp3移入CD25-的效應(yīng)性T細(xì)胞可使后者具有免疫抑制功能［15］，提示Foxp3對(duì)于Treg細(xì)胞功能發(fā)揮至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠Foxp3蛋白在脾Treg細(xì)胞中表達(dá)量顯著減少，在肺組織中卻顯著升高。既往報(bào)道也支持了本研究結(jié)果:Provoost等［12］發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量與正常者無(wú)顯著區(qū)別，但Treg細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)顯著下降;而Smyth等［16］發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中Treg細(xì)胞數(shù)量和Foxp3表達(dá)量均較正常組顯著升高。哮喘肺和肺外組織Foxp3蛋白表達(dá)存在差異，其機(jī)制尚未明確，可能和氣道炎癥相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者急性發(fā)作后，氣道炎癥加劇的同時(shí)BALF中Treg細(xì)胞數(shù)量顯著升高［14］，說(shuō)明哮喘肺內(nèi)Foxp3蛋白表達(dá)的升高可能與氣道炎癥時(shí)Treg細(xì)胞數(shù)量的增加相關(guān)。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，傳統(tǒng)效應(yīng)性T細(xì)胞大量增殖，同時(shí)Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3表達(dá)亦顯著升高［8］。故而哮喘肺組織中盡管Foxp3蛋白絕對(duì)數(shù)量增加，其相對(duì)于GATA-3水平可能是下降的，以上提示哮喘肺或肺外組織Foxp3蛋白都存在絕對(duì)或相對(duì)不足。

糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性均有很好的改善作用，其機(jī)制也與上調(diào)Treg細(xì)胞數(shù)量及Foxp3水平相關(guān)［17］。但長(zhǎng)期使用激素仍存在一定的副作用，如抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸，導(dǎo)致內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素分泌下降，以及產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素抵抗等［18］。故而從祖國(guó)中醫(yī)藥中開(kāi)發(fā)出有效藥物具有顯著臨床意義。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上［8］，進(jìn)一步證實(shí)了淫羊藿苷對(duì)哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性干預(yù)作用。淫羊藿苷的作用機(jī)制目前尚未闡明，本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可上調(diào)哮喘肺內(nèi)Foxp3蛋白的表達(dá)，但脾Foxp3平均熒光強(qiáng)度無(wú)顯著變化，這提示淫羊藿苷對(duì)哮喘單個(gè) Treg細(xì)胞Foxp3表達(dá)無(wú)顯著影響，其可能主要通過(guò)促進(jìn)肺內(nèi)Treg細(xì)胞的增加，從而使Treg細(xì)胞表達(dá)Foxp3蛋白總量增加。如上所述，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平與Treg細(xì)胞功能密切相關(guān)，而Treg細(xì)胞具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制Th1、Th2、Th17等效應(yīng)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，對(duì)控制哮喘氣道炎癥發(fā)揮重要作用［19］。故而淫羊藿苷對(duì)哮喘氣道高反應(yīng)和氣道炎癥的改善作用可能和其上調(diào)肺內(nèi)Foxp3蛋白水平相關(guān)。

此外，令人奇怪的是，我們發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷比地塞米松可更好地增加外周血IL-10水平。IL-10是一種抑炎因子，研究表明其可減少氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞數(shù)量，抑制IgE分泌，改善哮喘氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性［20］。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠血清IL-10顯著下降，而肺泡灌洗液各組間IL-10無(wú)顯著差異。既往有研究提示哮喘模型血清和肺泡灌洗液 IL-10 均較正常組下降［21，22］，也有報(bào)道哮喘患者急性發(fā)作時(shí)，肺泡灌洗液IL-10顯著增加［16］。研究表明Tr1調(diào)節(jié)T細(xì)胞，Th3調(diào)節(jié)T細(xì)胞，Th2細(xì)胞以及髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞等都可分泌IL-10，IL-10來(lái)源多樣性可能是報(bào)道差異的重要原因。但鑒于IL-10可減輕哮喘氣道炎癥，淫羊藿苷增加IL-10水平可能也與其抗炎機(jī)制相關(guān)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察哮喘小鼠Treg細(xì)胞及Foxp3蛋白的變化，以及淫羊藿苷的干預(yù)作用，提示哮喘脾Treg細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)下降，淫羊藿苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)肺內(nèi)Foxp3蛋白表達(dá)水平，增加外周血IL-10水平，從而改善哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。

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