肺結(jié)核患者外周血CD4+和CD8+記憶性T細(xì)胞亞群、IL-17、IL-27表達(dá)的初步探討①

鄢仁晴 方 寧 趙建軍 羅軍敏 羅建波 劉曉燕 (貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，遵義563003)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。結(jié)核病廣泛傳播的潛在危險(xiǎn)使得人們?cè)俅握J(rèn)識(shí)到疫苗開發(fā)研制的重要性。免疫記憶性是疫苗作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，在完成初次免疫應(yīng)答后淋巴細(xì)胞大部分被清除，只有極少數(shù)效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃浶訲細(xì)胞(Memory T lymphocyte，Tm)。如再次遇到相同抗原刺激，此類細(xì)胞可介導(dǎo)更快、更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。根據(jù)CD62L和CCR7分子表達(dá)的不同可以將記憶性T細(xì)胞分為兩大群［1］，一群是 CD62L+和 CCR7+細(xì)胞，稱為中央型記憶性T細(xì)胞TCM，與初始T細(xì)胞相似;主要分布于淋巴組織;而另外一群細(xì)胞是CD62L-和CCR7+，稱為效應(yīng)型記憶性T細(xì)胞TEM，主要分布于非淋巴組織，表達(dá)向炎癥部位遷移的趨化因子。當(dāng)受抗原刺激后，中央型記憶性T細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)型記憶性T細(xì)胞，發(fā)揮免疫應(yīng)答功能。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示［2］:TEM介導(dǎo)了保護(hù)性記憶，其遷移到外周炎癥部位并發(fā)揮效應(yīng)功能;而反應(yīng)性記憶則由TCM發(fā)揮，其歸巢到次級(jí)淋巴器官的T細(xì)胞區(qū)，幾乎沒有效應(yīng)功能，但能穩(wěn)定地增殖并在抗原刺激下分化為效應(yīng)細(xì)胞。IL-17是目前新發(fā)現(xiàn)的由CD4+記憶T淋巴細(xì)胞、CD8+細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，被認(rèn)為參與了機(jī)體多種炎性疾病的發(fā)生。IL-27具有誘導(dǎo)Th1反應(yīng)促炎性作用和減輕炎性反應(yīng)雙重作用，在抗感染免疫、抗腫瘤免疫及自身免疫性炎癥等Th1型免疫主導(dǎo)的病理過程中起重要作用。國外鮮見人肺結(jié)核外周血記憶性 T細(xì)胞的報(bào)道［3，4］，國內(nèi)學(xué)者做過相關(guān)基礎(chǔ)研究［5-7］，但未見肺結(jié)核患者外周血記憶性T細(xì)胞的報(bào)道，國外少見肺結(jié)核與IL-17、IL-27的相關(guān)研究報(bào)道［8-10］。所以擬以 CD4+(CD8+)CD45RA-CD62L-CCR7+作為效應(yīng)型記憶性T細(xì)胞(Effector memory T cell，TEM)表面標(biāo)志，CD4+(CD8+)CD45RA+CD62L+CCR7+作為中央型記憶性T細(xì)胞(Central memory T cell，TCM)表面標(biāo)志，用以探討肺結(jié)核患者外周血記憶性T細(xì)胞亞群的表達(dá)以及與IL-17、IL-27水平的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者組 收集2011年1月到12月30例住院病人及門診病人，經(jīng)呼吸內(nèi)科臨床診斷的繼發(fā)性肺結(jié)核(包括浸潤性肺結(jié)核、纖維空洞性肺結(jié)核及干酪性肺炎等)。參照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS288-2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》:a.兩次痰標(biāo)本涂片鏡檢抗酸桿菌陽性或分離培養(yǎng)分支桿菌陽性。b.胸部X線攝片顯示肺結(jié)核征象。具有咳嗽、咳痰、疲乏、胸悶氣短、胸痛、低燒、食欲不振、血痰或咯血、體重減輕、月經(jīng)失調(diào)等癥狀。c.五個(gè)單位結(jié)核菌素(OT或PPD-T)皮內(nèi)注射，72小時(shí)注射局部硬結(jié)反應(yīng)直徑≥5 mm。d.肺部病理標(biāo)本(手術(shù)、纖維支氣管鏡檢、肺穿刺等)經(jīng)病理學(xué)診斷為結(jié)核病變。具備a、b，或同時(shí)伴有c，d中一項(xiàng)者或同時(shí)具備a、d者，均可確診。

分組:(1)參照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核病分類》中化療史規(guī)定把患者分為初治組和復(fù)治組;初治組為凡既往未用過抗結(jié)核藥物治療或用藥時(shí)間少于一個(gè)月的新發(fā)病例;復(fù)治組為凡既往應(yīng)用抗結(jié)核藥物一個(gè)月以上的新發(fā)病例、復(fù)發(fā)病例、初治治療失敗病例等。(2)根據(jù)痰涂片抗酸染色分組:陽性為痰涂陽組，陰性為痰涂陰組。

所有病例均無心、肝、腎等臟器合并癥及其它感染，無糖尿病、腫瘤等免疫相關(guān)性或免疫性疾病，4個(gè)月內(nèi)未用過激素及免疫抑制劑，均在抗結(jié)核治療前采血。其中初治8例，復(fù)治22例。痰涂陽9例，痰涂陰21例。男/女:16/14例，平均年齡36歲，最大68歲，最小13歲。

1.1.2 健康對(duì)照組 隨機(jī)選擇20例健康正常者，均排除心、肝、腎等疾病，男/女:12/8例，平均年齡38歲，最大52歲，最小15歲。

1.2 標(biāo)本收集 記憶性T細(xì)胞數(shù)量檢測(cè):無菌操作取患者組及對(duì)照組清晨空腹靜脈血5 ml于EDTANa2抗凝管中，立即輕搖混勻，室溫保存，6小時(shí)內(nèi)測(cè)定。IL-17、IL-27水平檢測(cè):取普通管抽取靜脈血3 ml，分離血清，-20℃冰凍保存，待測(cè)。

表1 肺結(jié)核患者外周血記憶性T細(xì)胞亞群的表達(dá)(中位數(shù)，最小值，最大值，%)Tab.1 Expression of memory T cell subgroups in peripheral blood of pulmonary tuberculosis patients(median，min，max，%)

表2 肺結(jié)核患者血清IL-17和IL-27表達(dá)水平(ng/L)Tab.2 Level of IL-17 and IL-27 in peripheral blood of pulmonary tuberculosis patients(ng/L)

1.3 試劑及儀器 試劑:CD4-Percp、CD8-Percp、CCR7(CD197)-PE、CD45RA-FITC、CD62L-APC、鼠IgG1-PE、鼠IgG2a-PE、FACS溶血素、裂解液均購自美國BD公司;人IL-17、IL-27酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自美國R＆D systems公司;儀器:BD-FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)，DNM-9602G酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

1.4 流式分析操作方法 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EDTANa2抗凝的外周血記憶性T細(xì)胞:取100μl待檢樣本，分別加入 CD4-Percp、CD8-Percp、CCR7(CD197)-PE、CD45RA-FITC、CD62L-APC標(biāo)記抗體。按照常規(guī)方法進(jìn)行標(biāo)記，設(shè)相應(yīng)的同型對(duì)照，室溫閉光反應(yīng)30分鐘，然后加2 ml溶血?jiǎng)?分鐘后離心去上清，再加0.5～1.0 ml的 PBS液洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)，記錄陽性細(xì)胞百分率，減去非特異對(duì)照值，樣品在6小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.5 ELISA雙抗夾心法 測(cè)定肺結(jié)核患者外周血中IL-17、IL-27的含量。按照試劑盒說明書操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀定量檢測(cè)。

表3 肺結(jié)核患者記憶性T細(xì)胞亞群與IL-17/IL-27的相關(guān)性(r)Tab.3 The correlation analysis between memory T cells subgroups and IL-17/IL-27 in pulmonary tuberculosis patients(r)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否成正態(tài)分布，成偏態(tài)分布，采用中位數(shù)(最大值，最小值)描述數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)方法采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)，成正態(tài)分布采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差描述數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)采用兩樣本均數(shù)T檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用泊松分析。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀分析記憶性T細(xì)胞亞群 CD4+TEM 初治組和復(fù)治組，涂陽組和涂陰組均高于健康對(duì)照組(P＜0.05);CD4+TCM:初治組高于復(fù)治組 (P＜0.05)，涂陰組高于涂陽組(P＜0.05);CD8+TEM:初治組與涂陰組均低于健康對(duì)照組(P ＜0.05)，初治組低于復(fù)治組(P ＜0.05)，涂陰組低于涂陽組(P＜0.05);CD8+TCM:涂陰組高于涂陽組(P ＜0.05)，見表1。

2.2 ELISA法檢測(cè)肺結(jié)核患者外周血清IL-17/IL-2 7水平 IL-17復(fù)治組低于初治組和健康對(duì)照組(P＜0.05);IL-27:復(fù)治組高于初治組和健康對(duì)照組 (P ＜0.05)，見表2。

圖1 1例肺結(jié)核患者CD4+/CD8+記憶性T細(xì)胞流式分析圖譜Fig.1 One result of pulmonary tuberculosis patients of CD4+/CD8+memory T cells analyzed by flow cytometry

表4 肺結(jié)核患者IL-17與IL-27的相關(guān)性(r)Tab.4 The correlation analysis between IL-17 and IL-27 in pulmonary tuberculosis patients(r)

2.3 相關(guān)性分析 患者組CD4+和CD8+記憶T細(xì)胞與 IL-17、IL-27水平比較無顯著相關(guān)性(P＞0.05)，患者IL-17與IL-27比較有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，見表3、4。

2.4 流式分析圖譜 第一行圖譜R1為外周血淋巴細(xì)胞，R2是單核細(xì)胞，R3是中性粒細(xì)胞，第二行圖譜M1是CD4+和CD8+細(xì)胞，第三行圖譜R5是CD45RA+、CD62L+的 細(xì) 胞，R6 是 CD45RA-、CD62L-的細(xì)胞，第四行圖譜 CD45RA+、CD62L+、CD197+的細(xì)胞，第五行圖譜 CD45RA-、CD62L-、CD197+的細(xì)胞，如圖1。

3 討論

因?yàn)榻Y(jié)核病流行形勢(shì)的嚴(yán)峻和卡介苗抗結(jié)核保護(hù)作用的有限，故抗結(jié)核新疫苗的研制一直為人們所關(guān)注。結(jié)核分枝桿菌屬胞內(nèi)寄生菌，以T細(xì)胞免疫為主。記憶性T細(xì)胞在數(shù)量上、細(xì)胞膜表面分子的表達(dá)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和功能等方面均與初始T細(xì)胞有明顯不同［11］。

我們采用多種染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，以及國內(nèi)外常用鑒別記憶性T細(xì)胞表型標(biāo)志的抗體，在單個(gè)細(xì)胞水平上檢測(cè)肺結(jié)核患者外周血CD4+(CD8+)記憶性T細(xì)胞亞群的表達(dá)。結(jié)果表明患者組CD4+TEM表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［12-14］。肺結(jié)核是以Th1型細(xì)胞免疫來對(duì)付侵襲的結(jié)核分枝桿菌，CD4+效應(yīng)型記憶性T細(xì)胞在急性炎癥期表達(dá)增高，可以為機(jī)體提供免疫記憶保護(hù)。繼發(fā)性肺結(jié)核患者外周血CD4+TEM表達(dá)水平明顯高于正常人，可望作為臨床診斷繼發(fā)性肺結(jié)核的新型指標(biāo);CD8+TEM初治組與涂陰組均低于健康對(duì)照組(P＜0.05)，初治病例體內(nèi)免疫反應(yīng)向Th1方向極化，CD8+TEM帶有大量的顆粒酶和穿孔素，可對(duì)吞噬了大量抗原的靶細(xì)胞進(jìn)行呈遞和殺傷，CD8+TEM在結(jié)核感染初期或活動(dòng)期降低，與CD8+T功能細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)一致。有學(xué)者認(rèn)為CD8+T細(xì)胞的數(shù)量降低是結(jié)核病治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因［15］，本研究提示CD8+TEM降低，因此在研制新型結(jié)核疫苗中迫切需要解決如何提高CD8+T細(xì)胞的數(shù)量及其免疫應(yīng)答效率。

復(fù)治組CD4+TCM顯著低于初治組(P＜0.05)，復(fù)治組CD8+TEM細(xì)胞顯著高于初治組(P＜0.05)，CD4+TCM記憶性T細(xì)胞在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，在復(fù)治組表現(xiàn)為對(duì)原來抗原的再次入侵產(chǎn)生快速而強(qiáng)烈的克隆增殖反應(yīng)，并能有效地刺激樹突狀細(xì)胞，輔助B細(xì)胞，產(chǎn)生免疫效應(yīng)。在外周表現(xiàn)為數(shù)量減少，也可能為復(fù)治期CD4+中央型轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)型記憶細(xì)胞，發(fā)揮免疫應(yīng)答功能。復(fù)治組CD8+TEM增高是否由于結(jié)核菌的耐藥，不能對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行呈遞和殺傷，因此存活的CD8+TEM增加，還需進(jìn)一步探討。

涂陰組CD4+TCM顯著高于涂陽組 (P＜0.05)，涂陰組 CD8+TEM顯著低于涂陽組(P＜0.05)，涂陰組 CD8+TCM顯著高于涂陽組(P＜0.05)。通常涂陽組患者由于長(zhǎng)期帶菌，結(jié)核分枝桿菌在抗原刺激和自穩(wěn)細(xì)胞因子的作用下使得TCM分化為TEM，因此涂陽組TCM減少［16］。

范艷等［8］研究顯示機(jī)體外周血中存在著卡介苗(BCG)特異性記憶CD4+T細(xì)胞，這些記憶T細(xì)胞在體內(nèi)的產(chǎn)生是由于BCG免疫后所誘導(dǎo)，還是環(huán)境中分枝桿菌所致，需要進(jìn)一步探討。據(jù)本研究可以推斷結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)是可以產(chǎn)生特異性的CD4+記憶性T細(xì)胞，但是CD8+記憶性T細(xì)胞可能參與細(xì)胞殺傷作用而數(shù)量有所下降。

復(fù)治組IL-17水平低于健康對(duì)照組和初治組，與文獻(xiàn)［17］報(bào)道相符 ，IL-17在招募中性粒細(xì)胞聚集感染部位吞噬結(jié)核桿菌的同時(shí)也加重了感染部位的炎癥反應(yīng)。項(xiàng)杰等［18］報(bào)道結(jié)核病未治療組患者的IL-17水平升高，炎癥加重，經(jīng)治療一段時(shí)間后IL-17水平明顯下降，炎癥反應(yīng)降低，因此IL-17參與了機(jī)體抗結(jié)核桿菌感染的免疫反應(yīng)。復(fù)治組IL-27水平高于健康對(duì)照組和初治組，與文獻(xiàn)［19］報(bào)道相符，在炎癥早期，IL-27可以通過JAK/STATs途徑來促進(jìn)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞活化增殖產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1、IL-12、IL-18 和 TNF.［20］。記憶 T 細(xì)胞表達(dá) IL-27受體，當(dāng)受體缺失時(shí)，炎癥性細(xì)胞因子激活、IL-27產(chǎn)生增多［21］。IL-27在結(jié)核菌感染過程中發(fā)揮雙重作用，雖然阻止了抗結(jié)核菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)，但可以限制慢性炎癥造成的最終病理損害［22］。由此提示IL-17、IL-27參與了抗感染免疫的炎癥介導(dǎo)過程，尤其是參與了Th1型免疫主導(dǎo)的病理過程。各患者組IL-17、IL-27水平有顯著相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)兩者均參與了結(jié)核的抗感染免疫，有學(xué)者認(rèn)為IL-27可以通過JAK/ST AT1途徑抑制活化CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生 IL-17［23，24］。IL-17、IL-27 水平與記憶性 T 細(xì)胞的數(shù)量無明顯相關(guān)性，提示IL-17、IL-27可能未參與抗結(jié)核的免疫記憶過程，具體原因尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，肺結(jié)核患者外周血CD4+TEM記憶性T細(xì)胞的表達(dá)水平可望作為肺結(jié)核初步診斷的臨床觀察指標(biāo)，CD4+TCM和CD8+TEM兩者均可望作為肺結(jié)核患者的臨床分組依據(jù)。IL-17、IL-27可用于判斷肺結(jié)核的炎癥程度。我們將深入探討肺結(jié)核記憶性T細(xì)胞的變化，為CD4+和CD8+記憶性T細(xì)胞新型結(jié)核疫苗的研制打下基礎(chǔ)。

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