宮頸癌細(xì)胞通過(guò)分泌TSLP促進(jìn)自身細(xì)胞活力①

謝 鋒 孟玉菡 李明清 李大金

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院暨婦產(chǎn)科研究所生殖免疫教研室，上海200011)

胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)是一種IL-7樣細(xì)胞因子，最早在胸腺間質(zhì)細(xì)胞株培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)。TSLP是身體和環(huán)境界面(皮膚、呼吸道、腸道、眼組織等)介導(dǎo)Th2反應(yīng)的關(guān)鍵因子。近期研究發(fā)現(xiàn)，除了上皮細(xì)胞和表皮角質(zhì)細(xì)胞外，多種細(xì)胞包括肥大細(xì)胞、呼吸道平滑肌細(xì)胞、纖維細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞(DCs)、滋養(yǎng)細(xì)胞以及腫瘤和腫瘤相關(guān)細(xì)胞均可表達(dá) TSLP［1］。

TSLP參與多種病理生理過(guò)程。如通過(guò)活化樹(shù)突細(xì)胞促使CD4+T細(xì)胞呈現(xiàn)Th2免疫優(yōu)勢(shì)［2］，直接活化T細(xì)胞受體促進(jìn)T細(xì)胞增殖、產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子和促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)育和分化。此外，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤患者血清TSLP的表達(dá)增高［3］。TSLP誘導(dǎo)的Th2型炎性反應(yīng)與胰腺癌和乳腺癌的進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)［4，5］。我們課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)，人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的TSLP能促進(jìn)自身增殖和侵襲［6］?？紤]到滋養(yǎng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性，因此本研究是在前期研究的工作基礎(chǔ)上，檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞是否表達(dá)TSLP，并分析TSLP對(duì)宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa和Cas-Ki)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 試劑DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品;人TSLPELISA試劑盒和人重組的細(xì)胞因子TSLP均購(gòu)自R＆D公司;PE結(jié)合的抗人TSLPR流式抗體及其同型對(duì)照購(gòu)自Biolegend公司;MTT購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測(cè) HeLa和 CasKi細(xì)胞培養(yǎng)上清TSLP的濃度 將1×105細(xì)胞的HeLa或CasKi細(xì)胞接種于24孔板中，分別收集培養(yǎng)24、48和72小時(shí)的培養(yǎng)上清。按照人TSLP ELISA試劑盒的操作步驟檢測(cè)上清液TSLP的濃度。TSLP檢測(cè)敏感度為3.46 pg/ml，板內(nèi)、板間變異系數(shù)＜10%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3復(fù)孔。

圖1 CasKi和HeLa細(xì)胞不同時(shí)間上清中TSLP的濃度Fig.1 TSLP concentration in the supernatants of Cas-Ki and HeLa cells

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HeLa和CasKi細(xì)胞TSLPR的表達(dá) 常規(guī)胰酶消化HeLa和CasKi細(xì)胞，收獲的細(xì)胞加PE標(biāo)記抗人的TSLPR或同型對(duì)照，常溫孵育30分鐘，PBS洗滌后重懸細(xì)胞，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3復(fù)孔。

1.2.3 MTT法檢測(cè)HeLa和CasKi細(xì)胞的細(xì)胞活力

將5×103細(xì)胞的HeLa或CasKi細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)12小時(shí)后經(jīng)無(wú)血清DMEM+F12培養(yǎng)液饑餓12小時(shí)，然后經(jīng)溶媒、1、10或100 ng/ml TSLP處理24、48或72小時(shí)，隨后MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)6復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入SPSS13.0軟件系統(tǒng)，進(jìn)行t檢驗(yàn)或One-way ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 CasKi和HeLa細(xì)胞均分泌 TSLP 如圖1所示，ELISA結(jié)果顯示宮頸癌細(xì)胞株CasKi和HeLa細(xì)胞均分泌TSLP，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性(僅培養(yǎng)24小時(shí)的CasKi細(xì)胞TSLP分泌水平檢測(cè)不出)。與CasKi細(xì)胞相比，HeLa細(xì)胞早期(24小時(shí)和48小時(shí))分泌TSLP水平較高(P ＜0.05或P ＜0.01)，但是隨著時(shí)間的進(jìn)展，培養(yǎng)72小時(shí)時(shí)兩者TSLP的分泌水平無(wú)明顯差異(P ＞0.05)。

圖2 CasKi和HeLa細(xì)胞表面TSLPR的表達(dá)Fig.2 The expression of TSLPR of CasKi and HeLa cells

2.2 CasKi和HeLa細(xì)胞均表達(dá)TSLPR 流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48小時(shí)后的CasKi和HeLa細(xì)胞TSLPR陽(yáng)性表達(dá)率分別為 27.07 ±2.13 和 23.61 ±1.30，CasKi細(xì)胞表達(dá) TSLPR高于HeLa細(xì)胞(P＜0.05，圖2)。

2.3 TSLP增加 CasKi和 HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力不同濃度細(xì)胞因子TSLP作用CasKi和HeLa細(xì)胞后MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)TSLP各濃度組處理的細(xì)胞于24小時(shí)時(shí)不影響CasKi和HeLa細(xì)胞的活力(P＞0.05);低劑量組(1 ng/ml)TSLP亦不影響CasKi和 HeLa細(xì)胞活力(P＞0.05);而10或100 ng/ml的TSLP處理CasKi和HeLa細(xì)胞48或72小時(shí)后，均能顯著增強(qiáng)其細(xì)胞活力(P＜0.05，圖3)。

圖3 TSLP對(duì)CasKi和HeLa細(xì)胞活力的調(diào)節(jié)作用Fig.3 The regulation of TSLP on the viability of CasKi and HeLa cells

3 討論

TSLP是1994年被發(fā)現(xiàn)，主要由上皮細(xì)胞表達(dá)的一種造血細(xì)胞因子，人TSLP mRNA高表達(dá)于皮膚、心臟、肝臟、前列腺、胃腸道、肺和胸腺等器官［7］。最近研究發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞同樣分泌高水平TSLP，如:纖維母細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞等。TSLP的受體是由IL-7Rα鏈和TSLPR鏈組成的異質(zhì)二聚體。其中人TSLPR mRNA全長(zhǎng)1 579 bp，含一個(gè)由371 aa組成的開(kāi)放閱讀框，有一個(gè)跨膜區(qū)，為Ⅰ型跨膜蛋白，屬于造血細(xì)胞因子受體家族。人TSLP/TSLPR參與調(diào)節(jié)發(fā)揮多種生物學(xué)過(guò)程，如調(diào)節(jié)先天和獲得性免疫反應(yīng)，此外在過(guò)敏性皮膚病、呼吸道疾病、寄生蟲(chóng)感染和調(diào)節(jié)腸道免疫中具有重要作用。

我們課題組的前期工作已經(jīng)證實(shí)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的TSLP可以劑量依賴的方式促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲力［6］。母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞具有獨(dú)特的類似于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，即高增殖和侵襲能力。而國(guó)內(nèi)外的研究未見(jiàn)TSLP與宮頸癌的相關(guān)性報(bào)道，因此本課題借助ELISA和流式分別檢測(cè)了宮頸癌細(xì)胞株CasKi和HeLa細(xì)胞TSLP和TSLPR的表達(dá)特征。我們的結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)人宮頸癌細(xì)胞株CasKi和HeLa細(xì)胞均分泌TSLP，且共表達(dá)TSLPR，提示TSLP可能以自分泌的方式參與宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)控。

腫瘤最基本的特征是細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞的不斷增殖是腫瘤侵襲的前提，而增殖活性是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。為解析人重組細(xì)胞因子TSLP是否參與對(duì)CasKi和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力的調(diào)控，我們利用MTT試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的重組細(xì)胞因子TSLP處理細(xì)胞48或72小時(shí)可以增加CasKi和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力。

有研究顯示乳腺癌和肺癌細(xì)胞表達(dá)TSLP，且與腫瘤的增殖和侵襲相關(guān)［5，8］。如乳腺癌細(xì)胞能以一種依賴TSLP的方式誘導(dǎo)DCs表達(dá)OX40L。原發(fā)性乳腺癌浸潤(rùn)灶中發(fā)現(xiàn)OX40L+DCs。OX40L+DCs在體外促進(jìn)炎性Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-13和TNF。在異種移植模型中，TSLP和OX40L的中和性抗體均能抑制乳腺癌生長(zhǎng)和IL-13的產(chǎn)生［5］。因此，乳腺癌細(xì)胞來(lái)源的TSLP通過(guò)誘導(dǎo)DCs表達(dá)OX40L，促進(jìn)炎性Th2微環(huán)境，進(jìn)而促使腫瘤發(fā)展。

綜上所述，TSLP與宮頸癌增殖和侵襲可能存在一定的關(guān)系，對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能發(fā)揮了一定作用。我們推測(cè)TSLP對(duì)宮頸癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，一方面可能直接以自分泌的方式，活化下游STAT信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力;另一方面可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能改變來(lái)間接促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此進(jìn)一步解析TSLP調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的確切分子機(jī)制，對(duì)于闡明TSLP在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制，及宮頸癌的早期預(yù)防和臨床治療具有重要的理論意義。

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