鉀通道在系統(tǒng)性紅斑狼瘡T細胞中的作用研究①

邱紅霞 趙陰環(huán) 朱桂啟 趙?；?付冰冰 劉鑫鈺

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院風濕免疫科，哈爾濱150086)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多系統(tǒng)多器官的慢性自身免疫性疾病，其特征是免疫系統(tǒng)紊亂，導致抗核抗體(Antinuclear antibody，ANA)等自身抗體的產(chǎn)生、免疫復合物的沉淀以及補體系統(tǒng)的激活。SLE發(fā)病機制尚未完全明確，近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞鉀離子通道 Kv1.3(Voltage-gated potassium channel)和IKCa1(Intermediate-conductance calcium-activated potassium channel 1)對于啟動和維持免疫反應至關重要。本研究檢測了SLE外周血T細胞活化時Kv1.3及IKCa1通道的表達，以及阻斷Kv1.3通道后對SLE患者 T細胞增殖的影響，分析Kv1.3通道在SLE患者T細胞活化中的作用。探討Kv1.3通道作為SLE免疫治療靶點的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 33例SLE患者來自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院風濕免疫科2011年7月至2011年12月的住院患者，其中女性30例，男性3例，平均年齡35歲，所有患者均符合1997年美國風濕病學會(ACR)修訂的SLE分類標準。采用SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)-2K評分評估疾病活動性［1］;健康對照組12人為我院體檢中心的健康人，其中女性8名，男性4名，平均年齡32歲，均無風濕病史和風濕病家族史。研究組與對照組性別、年齡構成上差異無統(tǒng)計學意義。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準，并取得受試對象的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 PCR擴增儀(德國 Eppendorf公司);Lightcycler2.0實時定量PCR儀(德國QIAGEN公司，型號 RG-3000);UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司);酶標儀(瑞士TECAN公司)。人淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque)(天津灝洋生物制品科技有限公司)，純化抗人CD3單克隆抗體(美國eBioscience公司，克隆號OKT3)，All-in-One qPCR Mix(美國 GeneCopoeia公司)，Allin-One First-Strand cDNA Synthesis Kit(美國GeneCopoeia公司);Kv1.3、IKCa1 及 β-Actin 引物(美國Genecopoeia公司，貨號分別為 Hs-QRP-20905、Hs-QRP-20903、Hs-QRP-20056);ShK(以色列 Alomone公司);CCK-8(碧云天生物技術研究所)。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 外周血T細胞培養(yǎng) 晨起無菌采集外周靜脈血10 ml，枸櫞酸鈉抗凝。應用Ficoll-Hypaque按照操作說明密度梯度離心法分離PBMC，之后應用尼龍毛柱法提取T細胞。以含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×106ml-1，按照1 ml/孔接種于24孔培養(yǎng)板;每孔中加抗CD3單抗刺激T細胞活化，終濃度為0.5μg/ml;5%CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。

1.2.2.2 熒光實時定量PR-PCR檢測活化 T細胞中Kv1.3通道和IKCa1通道m(xù)RNA表達水平 收集培養(yǎng)細胞，Trizol法提取總RNA，根據(jù)All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Kit(美國GeneCopoeia公司)說明配制反應體系，逆轉錄合成cDNA。據(jù)Allin-One qPCR Mix(美國GeneCopoeia公司)說明配制RT-PCR反應體系。反應體系如下:2×All-in-one qPCR Mix 10 μl，PCR 上游引物(2 μmol/L)2 μl，PCR 下游引物(2 μmol/L)2 μl，cDNA 2 μl，去離子水4μl。反應程序為:95℃預變性10分鐘;95℃反應10秒，60℃反應20秒，72℃反應15秒，共進行45個循環(huán)。

1.2.2.3 CCK-8 法檢測阻斷 Kv1.3 通道對 SLE 患者T細胞增殖的影響 向96孔培養(yǎng)板中加入100 μl細胞懸液，將細胞分為抗CD3單抗組和抗CD3單抗+ShK組，設空白孔，只加含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液及抗CD3單抗。37℃培養(yǎng)72小時后，向每孔中加入10μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)4小時。在酶標儀上于450 nm處測定吸光度OD值。計算相對增殖指數(shù):相對增殖指數(shù)=(不同處理組OD值-空白孔OD值)/(抗CD3單抗組OD值-空白孔OD值。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，對組間實驗數(shù)值比較采用t檢驗，對Kv1.3和IKCa1通道m(xù)RNA相對表達量與補體C3、C4、抗dsDNA抗體、SLEDAI積分及尿蛋白間進行相關性分析。P＜0.05具有統(tǒng)計學意義

2 結果

2.1 Kv1.3、IKCa1 mRNA表達情況 利用實時定量PCR分析軟件自動生成相關數(shù)據(jù)，分析SLE患者T細胞活化后與對照組之間 Kv1.3及 IKCa1的mRNA表達水平的差異。結果顯示，Kv1.3通道m(xù)RNA的相對表達值為 2.36±0.64，正常對照為1.04±0.32;IKCa1通道 mRNA 的相對表達值為0.77 ±0.19，正常對照者為 0.98 ±0.19。SLE 患者Kv1.3通道m(xù)RNA的表達與正常對照相比明顯增高，而IKCa1通道m(xù)RNA的表達與正常對照相比明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P值分別為P＜0.001，P=0.006)，如圖1 所示。

表1 SLE組Kv1.3及IKCa1 mRNA表達水平與補體C3、C4、抗dsDNA抗體、尿蛋白量及SLEDAI積分間的相關性Tab.1 The correlation between the Kv1.3 and IKCa1 mRNA expression level and complement C3，C4，SLEDAI scores，urinary protein，anti-dsDNA antibody in SLE group

2.2 SLE患者Kv1.3及IKCa1mRNA表達水平與補體C3、C4、抗dsDNA抗體、SLEDAI積分及尿蛋白間的相關性分析 SLE患者Kv1.3及IKCa1 mRNA表達水平均與補體C3、C4、抗dsDNA抗體、SLEDAI積分及尿蛋白無相關性。如表1所示。

圖1 SLE組和對照組Kv1.3及IKCa1 mRNA表達水平Fig.1 The expression of Kv1.3 and IKCa1 channels in activated T cells of SLE and in controls

圖2 CCK-8法測SLE T細胞加入ShK后相對增殖指數(shù)Fig.2 The effects of blocking Kv1.3 channels with ShK on T cell proliferation were measured by CCK-8 assay

2.3 CCK-8法檢測阻斷Kv1.3通道對SLE患者T細胞增殖的影響 本實驗用CCK-8法檢測T細胞的增殖，通過OD值計算相對增殖指數(shù)，分析ShK阻斷Kv1.3通道后對SLE患者T細胞增殖的影響。結果顯示，加入ShK后，SLE患者T細胞的相對增殖指數(shù)由1.00 ±0.13 降為 0.77 ±0.15，兩者間有顯著差異(P＜0.001)，提示ShK可明顯抑制SLE患者T細胞增殖，如圖2所示。

3 討論

近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞K通道Kv1.3和IKCa1對于啟動和維持免疫反應至關重要。T細胞表面表達的兩種主要的K通道是Kv1.3和IKCa1，研究發(fā)現(xiàn)這兩種K通道的表達與免疫細胞的活化狀態(tài)有關［2，3］。在受到抗原的反復刺激后，CD4+和CD8+T細胞會由初始T細胞分化為TCM和TEM記憶性T細胞亞群，同時會伴隨著T細胞膜表面鉀離子通道類型的改變。在靜息狀態(tài)，初始T細胞，TCM細胞以及TEM細胞表達的Kv1.3(200～400個/細胞)明顯高于IKCa1(8～10個/細胞);受抗原或絲裂原激活后，初始T細胞和TCM細胞表達Kv1.3(250～300個/細胞)和 IKCa1(500～600個/細胞)的數(shù)量相當，而TEM細胞活化后表達的Kv1.3(1800個/細胞)顯著高于 IKCa1(50～100個/細胞)［4］。這說明兩種鉀離子通道在活化的初始T細胞、TCM細胞和TEM細胞表達不同，發(fā)揮的作用也不同。Kv1.3通道是TEM細胞活化的主要鉀離子通道，而在初始T細胞和TCM活化時，IKCa1通道表達增加，發(fā)揮主要功能［5］。

過去研究發(fā)現(xiàn)在SLE患者中存在一系列的信號異常，尤其是T細胞表現(xiàn)出對抗原刺激的過度應答。這種“過度活化”T細胞的標志是，在T細胞受體(TCR)與抗原肽結合后，與正常T細胞相比，表現(xiàn)出更顯著的并且持續(xù)性增加的胞內(nèi)Ca2+水平［6］。持續(xù)的Ca2+內(nèi)流對下游信號活化和T細胞功能起著重要作用。因此，在 SLE患者T細胞中，胞內(nèi)Ca2+水平調(diào)節(jié)異?？梢詫е耇細胞功能異常。

在T細胞中TCR介導的Ca2+內(nèi)流是通過鈣釋放活化鈣通道(CRAC)實現(xiàn)的，并且受多種膜通道和信號分子的調(diào)節(jié)［7］?？乖c TCR的結合活化PLC-γ并誘導胞內(nèi)儲存Ca2+釋放。胞內(nèi)儲存Ca2+排空后，引起CRAC通道開放，Ca2+流入胞內(nèi)。持續(xù)的Ca2+內(nèi)流是T細胞活化所必需的，從而調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞因子的產(chǎn)生。Ca2+內(nèi)流的電化學驅動力是由陽離子通過K通道外流所提供的。

為了研究SLE患者T細胞中鉀通道的作用，本研究用抗CD3單抗刺激T細胞活化，分析活化的外周血T細胞中Kv1.3及IKCa1通道的表達情況，并分析其與SLEDAI積分、補體、抗dsDNA抗體及尿蛋白的關系。結果提示SLE組Kv1.3通道表達量與正常對照組相比明顯增加，而IKCa1通道的表達量與正常對照組相比減少，這兩種通道的表達與SLE病情活動指標SLEDAI積分、補體、抗dsDNA抗體、及尿蛋白之間無相關性。有研究發(fā)現(xiàn)SLE患者中TEM細胞增加［8］，作為TEM細胞活化的主要鉀離子通道，Kv1.3通道的活動變化可能影響T細胞對抗原的識別及T細胞的活化。選擇性阻斷K通道，可抑制T細胞活化，從而控制SLE發(fā)病。對Kv1.3通道的進一步研究，有助于研究Kv1.3通道阻斷劑通過調(diào)節(jié)Kv1.3通道來干擾T細胞活化的藥理作用及新藥研制。

為了研究Kv1.3通道阻斷劑對T細胞增殖的影響，本實驗進行了CCK-8法檢測阻斷Kv1.3通道對SLE患者T細胞增殖的影響。結果顯示，ShK可明顯抑制SLE患者T細胞增殖。這提示Kv1.3通道是SLE患者TEM細胞活化的主要離子通道，Kv1.3通道可成為SLE免疫治療的一個新靶點。

鉀離子通道的電生理學試驗表明在SLE患者T細胞中，Kv1.3通道電流強度比IKCa1高，SLE患者T細胞中Kv1.3通道表達量平均為349±30通道/細胞，IKCa1通道表達量平均為 30.7±2.5通道/細胞;并且發(fā)現(xiàn)在IS區(qū)域Kv1.3通道的動力學發(fā)生改變，與正常對照者靜止性T細胞相比，在SLE患者T細胞中Kv1.3通道轉移至IS區(qū)域有更快的動力學。并且這種現(xiàn)象與SLE病情活動及是否接受免疫抑制劑治療無關［8］。因此，Kv1.3通道是SLE患者T細胞的主要K電導通道，并且是細胞電位和鈣平衡的主要調(diào)節(jié)因子。Kv1.3通道狀態(tài)的改變對SLE患者T細胞的Ca2+平衡有很多影響。

Rus等［9］對MS患者腦組織的病理研究證實，在MS腦組織的血管周圍及脫髓鞘病灶中的T淋巴細胞上大量表達Kv1.3通道，其中大部分的T細胞為TEM細胞。研究發(fā)現(xiàn)在再生障礙性貧血患者中存在 Kv1.3highIKCa1lowTEM細胞增多，特異性 Kv1.3 阻斷劑ShK可明顯抑制TEM細胞增殖，并抑制IFN-γ和IL-4的產(chǎn)生［10］。其他體外研究也證明Kv1.3阻斷劑能有效治療多種T細胞介導的免疫反應，如大鼠和小型豬的遲發(fā)型超敏反應，實驗性自身免疫型糖尿病，異十八烷誘導的關節(jié)炎和大鼠中變應性接觸性皮炎，并沒有出現(xiàn)任何毒副作用［11，12］。在這些疾病模型中，Kv1.3通道阻斷劑選擇性抑制TEM細胞功能，但對初始T細胞和TCM細胞的歸巢及向淋巴結的遷移沒有影響［13］，因為初始和TCM細胞可以通過上調(diào)IKCa1通道而逃避免疫抑制，使得正常的免疫應答不受影響，靶向Kv1.3通道的治療方法比全身免疫調(diào)節(jié)的治療更有優(yōu)勢。

Kv1.3通道在抑制自身免疫性疾病的免疫異常中有獨特的優(yōu)勢，但Kv1.3通道阻斷劑可否用于SLE及其他自身免疫性疾病的治療，尚需進一步對Kv1.3通道阻斷劑藥理學特性、生物利用度及安全性進行深入研究。

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