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    自制NSE單抗的鑒定及其雙抗夾心ELISA方法的建立①

    2012-07-30 13:33:20丁煥弟林志妙于占嬌龔慧婷李曉彤
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2012年10期
    關(guān)鍵詞:夾心單克隆特異性

    丁煥弟 林志妙 楊 赟 于占嬌 龔慧婷 李曉彤

    (廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院雜交瘤抗體中心,廈門361005)

    神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)是烯醇化酶的一種同工酶,烯醇化酶是普遍存在于生物體內(nèi)的糖酵解代謝酶,它催化中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸的生成。目前已發(fā)現(xiàn)5種烯醇化酶的同工酶,由3種免疫性質(zhì)不同的亞基(α、β、γ)組成,分別是 αα、ββ、γγ、αβ、αγ,已經(jīng)證明這 3個(gè)亞基來(lái)自不同的基因位點(diǎn)[1]。α亞基主要存在于肝、腎等組織,故稱其為非神經(jīng)系統(tǒng)的烯醇化酶(NNE);β亞基主要存在于骨骼肌和心肌,故稱其為肌肉特異性的烯醇化酶(MSE);γ亞基主要存在于神經(jīng)組織,γγ型特異定位于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中,故命名為神經(jīng)元特異性烯醇化酶[2]。

    通過(guò)研究神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞起源的腫瘤,如小細(xì)胞肺癌患者血清及腦脊液中NSE水平明顯升高,提出通過(guò)對(duì)這些患者血清NSE活性水平變化的監(jiān)測(cè),可以達(dá)到監(jiān)測(cè)病情發(fā)展,評(píng)價(jià)治療效果,及早提示復(fù)發(fā)情況的目的。

    本文希望通過(guò)制備效價(jià)高、特異性好、能識(shí)別人體內(nèi)NSE蛋白的單克隆抗體,并用此抗體建立雙抗夾心ELISA試劑盒。

    1 材料與方法

    1.1 材料 PEG、HT、HAT、RPMI1640 培養(yǎng)基、抗體亞型鑒定試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG以及熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購(gòu)自Sigma公司;小牛血清購(gòu)自Gibco。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)自泰天和生物公司,其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.2 方法

    1.2.1 NSE單克隆抗體的制備及亞型鑒定 取小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合[3],通過(guò)間接 ELISA 法篩選[4],采用有限稀釋法進(jìn)行數(shù)次亞克隆,獲得可穩(wěn)定分泌NSE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,按常規(guī)方法制備腹水并純化。采用間接ELISA法梯度稀釋制備的抗體,測(cè)定其效價(jià),并采用免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞型鑒定試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定,用山羊抗鼠 IgA、IgM、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,檢測(cè)抗體的亞型,亞型鑒定的具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

    1.2.2 免疫印跡分析(Western blot,WB) 將收集的細(xì)胞裂解液,首先進(jìn)行SDS-PAGE電泳;然后用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉,室溫2小時(shí);加一抗,室溫孵育1小時(shí),PBST洗滌;加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1小時(shí),PBST充分洗滌;加入顯色液顯影攝片。

    1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有無(wú)水乙醇浸泡過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后。4%多聚甲醛固定10分鐘;加滲透液置冰上滲透10分鐘;5%的BSA封閉1小時(shí);加一抗孵育3小時(shí),洗滌;加熒光二抗室溫避光孵育1小時(shí),洗滌;DAPI染核5分鐘,洗滌;封片,鏡檢拍片。

    1.2.4 免疫組化 組織切片脫蠟與水化后,進(jìn)行抗原修復(fù);再用3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性;用正常山羊血清封閉液封閉。滴加稀釋好的一抗,室溫靜置1小時(shí)或4℃過(guò)夜,洗滌;滴加生物素標(biāo)記的二抗,洗滌;滴加鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液,洗滌;AEC顯色,在顯微鏡下觀察掌握染色程度,洗滌;蘇木素復(fù)染,洗滌;封片、鏡檢拍片。

    1.2.5 雙抗夾心ELISA法檢測(cè)系統(tǒng)的建立 用活化的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體試劑盒,對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記。按ELISA雙抗體夾心法測(cè)抗原的基本試驗(yàn)程序[5],采用棋盤滴定試驗(yàn)。取純化后的數(shù)株抗體分別稀釋至 1、2、4、8 mg/ml,包被酶標(biāo)板。分別與100、500 ng/ml的NSE融合蛋白反應(yīng),以BRCA1融合蛋白為陰性對(duì)照,0.2%的BSA為空白對(duì)照。然后再分別加入不同濃度酶標(biāo)抗體,稀釋度1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 和 1∶16 000。讀取 OD450 值。根據(jù)OD值和P/N值,確定包被抗體和酶標(biāo)抗體的最佳搭配和工作濃度,建立ELISA檢測(cè)系統(tǒng)。

    1.2.6 封閉條件以及酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的優(yōu)化

    以2%BSA為封閉液,BRCA1融合蛋白為陰性對(duì)照,0.2%BSA為空白對(duì)照。選擇37℃封閉2小時(shí)、37℃封閉4小時(shí)和4℃封閉過(guò)夜,然后進(jìn)行夾心ELISA反應(yīng),以確定最適合封閉條件。確定最適封閉條件后,在最適的酶標(biāo)抗體濃度下,將反應(yīng)時(shí)間設(shè)為:37℃,30分鐘、50分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)和2小時(shí),以確定酶標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)時(shí)間。

    1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及靈敏度的確定 取標(biāo)準(zhǔn)的NSE融合蛋白,自1 000 ng/ml開始倍比稀釋,以BRCA1融合蛋白為陰性對(duì)照,0.2%BSA為空白對(duì)照。進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測(cè),重復(fù)3次,每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以O(shè)D450值為縱坐標(biāo),NSE融合蛋白濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.8 試劑盒特異性檢測(cè) 我們采用雙夾心ELISA法來(lái)檢測(cè),分別用NSE融合蛋白、BRCA1融合蛋白、標(biāo)簽蛋白和BSA蛋白做交叉反應(yīng)來(lái)檢測(cè)雙夾心試劑盒的特異性,稀釋檢測(cè)蛋白濃度為100 ng/ml,進(jìn)行雙夾心ELISA檢測(cè)。

    1.2.9 試劑盒重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測(cè) 將我們的抗體包被好酶標(biāo)板,置于4℃儲(chǔ)存3個(gè)月,重復(fù)我們的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)。梯度稀釋蛋白分別為 1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 ng/ml,每個(gè)濃度做 3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算 P/N值,以P/N≥2.1所對(duì)應(yīng)的NSE融合蛋白的最低濃度,作為該試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)極限,與初始的最低檢測(cè)極限進(jìn)行比較。

    2 結(jié)果

    2.1 抗體效價(jià)及亞型鑒定 我們采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)得到穩(wěn)定分泌抗NSE抗體的雜交瘤細(xì)胞,并制備腹水,將所抽取的腹水使用以Protein G進(jìn)行親和純化,采用間接ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3號(hào)和4號(hào)抗體效價(jià)最高,達(dá)到4.2×107~6.5×107??贵w亞類的測(cè)定結(jié)果顯示,抗體的亞型為IgG2b(圖1)。

    圖1 單克隆抗體亞型鑒定Fig.1 The isotype identification of NSEmAbs

    圖2 NSE單克隆抗體的WB檢測(cè)Fig.2 Western blot with our NSEmAb

    2.2 NSE單克隆抗體的WB檢測(cè) 我們采用過(guò)表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)NSE單克隆抗體,將帶有HA標(biāo)簽的NSE真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,進(jìn)行WB檢測(cè)。結(jié)果在50 kD左右檢測(cè)到了目的蛋白NSE(圖2A)。接著我們用自制的NSE抗體,進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)源NSE蛋白的檢測(cè),結(jié)果顯示,未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中,可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)源NSE蛋白的表達(dá)(圖2B),以轉(zhuǎn)染了NSE真核表達(dá)載體的293T細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照指示NSE的位置。

    然后我們將帶HA標(biāo)簽的NSE真核表達(dá)載體梯度轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染前各盤細(xì)胞換等量的細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染帶HA標(biāo)簽的NSE真核表達(dá)載體DNA 分別為0、1、2、4 μg;轉(zhuǎn)染空載體的 DNA 分別為4、3、2、0 μg。轉(zhuǎn)染 36 小時(shí)后,收集細(xì)胞上清,并將細(xì)胞裂解,進(jìn)行WB檢測(cè)。結(jié)果表明,我們的抗體可在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到目的蛋白NSE,與細(xì)胞裂解液中NSE的位置相同,而且隨著我們轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的量增加而增多(圖3)。

    圖3 檢測(cè)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NSE蛋白Fig.3 Detection of secreted NSE protein in cell culture medium

    圖4 內(nèi)源免疫熒光檢測(cè)NSE(×100)Fig.4 Immunofluorescence detection of NSE( ×100)

    2.3 NSE抗體免疫熒光檢測(cè) WB檢測(cè)表明在許多不同癌細(xì)胞株中都有NSE的大量表達(dá)(結(jié)果未在本文顯示),用免疫熒光方法對(duì)圖4中的3株細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明在肺癌細(xì)胞H299,乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中可檢測(cè)到目的蛋白NSE,其定位于細(xì)胞質(zhì)中,而在HeLa細(xì)胞中則未檢測(cè)到NSE(圖4)。

    2.4 NSE抗體免疫組化檢測(cè) 取乳腺癌的組織切片,進(jìn)行染色。結(jié)果顯示:自制的NSE單克隆抗體可在乳腺癌組織中檢測(cè)到NSE蛋白,其中藍(lán)色部分為蘇木素染核的顏色,紅褐色為我們的抗體著色部位,主要位于胞漿(圖5)。

    2.5 雙抗夾心ELISA法檢測(cè)系統(tǒng)的建立 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果表明#4抗體的效價(jià)最高,因此對(duì)其進(jìn)行了HRP標(biāo)記。棋盤滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,#3抗體和酶標(biāo)#4抗體配對(duì)效果最好,#3NSE抗體包被濃度為2μg/ml,酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶4 000時(shí)效果最佳。在蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100 ng/ml時(shí),#3和酶標(biāo)#4抗體各組合的P/N值見表1。

    表1 棋盤滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The result of Checkboard ELISA

    圖5 NSE單克隆抗體的免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining with NSE antibody

    圖6 雙抗夾心ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of double-antibody sandwich ELISA

    2.6 雙抗夾心ELISA法的優(yōu)化 在檢測(cè)蛋白濃度為300 ng/ml時(shí),以O(shè)D450值和 P/N值為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)。不同封閉條件下的結(jié)果顯示,4℃過(guò)夜時(shí)陽(yáng)性和陰性值都稍微偏高,37℃封閉4小時(shí)和2小時(shí)差別不大。酶標(biāo)抗體在作用時(shí)間50分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)時(shí)OD值之間差異不明顯。在作用30分鐘和2小時(shí)時(shí)與其它組之間OD值差異明顯,但作用30分鐘時(shí)陽(yáng)性O(shè)D值偏低;在2小時(shí)時(shí)陰性值偏高,P/N值偏低,易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。最后考慮到時(shí)間和OD值問(wèn)題,我們選擇封閉條件為37℃,2小時(shí),酶標(biāo)抗體作用時(shí)間為1小時(shí)。

    圖7 雙抗夾心ELISA特異性檢測(cè)Fig.7 Specificity detection of double-antibody sandwich ELISA

    2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度在500~7.81 ng/ml檢測(cè)范圍內(nèi),曲線趨近直線,線性關(guān)系最佳,以O(shè)D450值為縱坐標(biāo),NSE融合蛋白濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)。通過(guò)計(jì)算9個(gè)陰性孔的平均值(x)為 0.485 56,以 P/N≥2.1(P=0.101 968,N=0.048 556) 的最低 NSE 融合蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算試劑盒的最低檢測(cè)極限為8.85 ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為 0.01 007 135,吸收值x+2SD=0.058 627 35,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=0.321x-0.202,R2=0.996,其相對(duì)應(yīng)的濃度為 6.49 ng/ml,即該方法的檢測(cè)靈敏度為6.49 ng/ml。

    2.8 試劑盒的特異性的鑒定 以檢測(cè)蛋白濃度為100 ng/ml對(duì)試劑盒的特異性進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,NSE雙夾心試劑盒與NSE融合蛋白結(jié)合的OD450值,顯著高于與其它蛋白結(jié)合的OD450值(圖7)。

    2.9 雙單抗夾心ELISA法的可重復(fù)性及穩(wěn)定性鑒定 用#3NSE抗體包被好的酶標(biāo)板,置于4℃儲(chǔ)存3個(gè)月后,重復(fù)我們建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果回歸方程為y=0.322x-0.239,R2=0.995,最低檢測(cè)極限為 11.45 ng/ml。OD450 值與儲(chǔ)存前有一定的區(qū)別,但曲線斜率、最低檢測(cè)極限與儲(chǔ)存前變化不大,并不影響試劑盒本身的測(cè)定,說(shuō)明該試劑盒在4℃條件下至少可以保存3個(gè)月,我們的試劑盒具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

    3 討論

    神經(jīng)元特異性烯醇化酶是目前公認(rèn)的小細(xì)胞肺癌高特異性、高敏感性的腫瘤標(biāo)志物[6,7],并與病情的分期密切相關(guān)。因此,開發(fā)一種準(zhǔn)確、方便和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法,對(duì)該指標(biāo)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用具有重要意義。自從Reeve[8]于1986年成功地制作了NSE單克隆抗體以來(lái),其在APUD腫瘤中的診斷已得到了廣泛的應(yīng)用。

    本實(shí)驗(yàn)中自制的NSE單克隆抗體效價(jià)高、穩(wěn)定性好,并對(duì)這些單抗進(jìn)行了WB、IF、IHC多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn),證實(shí)我們的抗體可特異性地識(shí)別細(xì)胞的NSE蛋白,特別是該抗體可以很好地識(shí)別分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的NSE蛋白,為將來(lái)進(jìn)行臨床血液檢測(cè)打下良好的基礎(chǔ)。同時(shí)本研究所建立的雙抗夾心ELISA定量檢測(cè)方法及可行性的初步驗(yàn)證,為相關(guān)診斷試劑盒的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

    1 Jacobi C,Reiber H.Clinical relevance of increased neuron-specific enolase concentration in cerebrospinal fluid[J].Clin Chim Acta,1988;177(1):49-54.

    2 Schaarschmidt H,Prange H W,Reiber H et al.Neuron-specific enolase concentrations in blood as a prognostic parameter in cerebrovascular diseases[J].Stroke,1994;25(3):558-565.

    3 邱玉華,張學(xué)光.鼠抗人sIL-6RmAb的制備及sIL-6R檢測(cè)方法的建立[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,1997;13(4):58-60.

    4 徐志凱.實(shí)用單克隆抗體技術(shù)[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,1992:42-45.

    5 鮑建芳,沈建根.免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,2006:26-28.

    6 李 蓉,李 睿.肺癌腫瘤標(biāo)記物研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)· 腫瘤分冊(cè),1996;23(2):98-103.

    7 楊德昌,楊拴盈.肺癌診斷水平的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2001;24(8):450-451.

    8 Reeve J L,Stewart J,Watson J V et al.Neuron specific enolase expression in carcinoma of the lung[J].Br J Cancer,1986;53(4):519-528.

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