阿維鏈霉菌原生質(zhì)體制備方法的研究

張 毅

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064）

1975年，日本北里研究所（Kitasato Insitute）從日本靜岡縣伊東市河奈（Kawana）地區(qū)一個(gè)土壤樣品中分離得到一株鏈霉菌[1]。美國(guó)默克公司（Merck）的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和分類鑒定結(jié)果證明，它是鏈霉菌屬的一個(gè)新種，定名為Streptomyces avermitllis，原始菌株編號(hào)為A-4680。后來(lái)該驅(qū)蟲活性物被鑒定為是一族結(jié)構(gòu)相似的16元環(huán)大環(huán)內(nèi)脂類化合物，含有8個(gè)結(jié)構(gòu)相似的組分，分別編號(hào)為 Ala，A2a，Alb，A2b，B1a，B2a，Blb 和 B2b[2]。盡管 Streptomyces avermitllis產(chǎn)生8個(gè)組分的阿維菌素，但只有B1組分的殺蟲活性最高，毒性最小，被作為殺蟲劑在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中廣泛使用。為了提高活性、擴(kuò)大抗蟲譜和降低毒性，研究人員對(duì)阿維菌素進(jìn)行了誘變、生物轉(zhuǎn)化和化學(xué)修飾等一系列的改造[3]。阿維菌素優(yōu)良菌株的選育有著重要意義和實(shí)用價(jià)值。20世紀(jì)70年代以來(lái)，各種原生質(zhì)體操作技術(shù)己成為工業(yè)微生物育種的重要手段，并取得了較大的成就。以微生物原生質(zhì)體為材料的常見(jiàn)育種方法有原生質(zhì)體再生育種、原生質(zhì)體誘變育種、原生質(zhì)體融合育種及基因組重排育種等。筆者圍繞原生質(zhì)體制備的方法，以工業(yè)阿維鏈霉菌為研究對(duì)象，進(jìn)行了原生質(zhì)體制備的研究，旨在為阿維菌素菌種選育提供理論支持和技術(shù)幫助。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 阿維鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株Z1，由武漢天惠生物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 鏈霉菌孢子培養(yǎng)基（MS）：黃豆粉20 g，甘露醇 20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，115℃、25 min滅菌2次，每1 000 mL加入2.5 mol/L的MgCl24 mL。鏈霉菌菌絲培養(yǎng)基（YEME）：Difco酵母粉3 g，Difco蛋白胨5 g,Oxoid麥芽3 g，葡萄糖 10 g，蔗糖 103 g,蒸餾水 1 000 mL，115℃滅菌 25 min，臨用前按2 ml/L補(bǔ)加2.5 mol/L MgCl2·6H2O，制備原生質(zhì)體時(shí)按25 ml/L加入20%甘氨酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備 在裝有不銹鋼珠的250 mL三角瓶中加入25 mL YEME培養(yǎng)基。加入大約0.1 mL孢子懸液及所需生長(zhǎng)因子后，在30℃旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)36～40 h。將培養(yǎng)物倒入20 mL的旋蓋小瓶中，3 000 r/min離心10 min收集菌絲體，棄去上清液。將菌絲體沉淀懸浮于15 mL 10.3%的蔗糖溶液中，3 000 r/min離心10 min。重復(fù)上一步驟，棄去上清液，將菌絲體懸于10 mL溶菌酶溶液（2 mg/mL，溶于P緩沖液）中，30℃保溫15～60 min。用5 mL吸管吹吸3次，保溫15 min。補(bǔ)加5 mL P緩沖液，用5 mL吸管再次吹吸。用裝有脫脂棉的試管過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入塑料管中。3 000 r/min離心7 min，沉淀原生質(zhì)體，棄去上清液，將原生質(zhì)體懸浮于1 mL P緩沖液[4]中備用。

1.2.2 原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)方法 利用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體制備液放在血球計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室中，放上載玻片，在高倍鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，在每個(gè)中方格中數(shù)4個(gè)小方格（每個(gè)小方格控制在5～10個(gè)單位為宜），記錄5個(gè)中方格（即20個(gè)小方格）的總菌數(shù)，重復(fù)計(jì)數(shù)2次，取平均值。計(jì)算公式：

單位體積的總菌數(shù)（1 mL）=2×105×A×B

式中A為20個(gè)小方格中的總菌數(shù)，B為懸液稀釋度。

1.2.3 原生質(zhì)體的再生 將已經(jīng)制備好的原生質(zhì)體懸浮液，分別以高滲P緩沖液以及無(wú)菌水稀釋后，涂布于再生培養(yǎng)基平板上，置于28℃保溫培養(yǎng)7～10 d，待長(zhǎng)成菌落后分別計(jì)數(shù)。

1.2.4 原生質(zhì)體融合和再生 采用PEG誘導(dǎo)融合法，用高滲P緩沖溶液稀釋2株親本菌株原生質(zhì)體懸浮液，等量混合，混勻之后，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液。加少量高滲P緩沖溶液將原生質(zhì)體沉淀懸浮，再加入含0.05 mol/L CaCl2，0.02 mo1/L MgCl2和50%PEG 1 000的高滲P緩沖液2.5 mL，輕微振蕩混勻，25℃保溫5 min后，加高滲P緩沖溶液2.5 mL，洗滌、離心，重復(fù)洗滌1次。融合的原生質(zhì)體經(jīng)梯度稀釋后接種于再生培養(yǎng)基上，28℃保溫培養(yǎng)7～10 d，待長(zhǎng)成菌落后分別計(jì)數(shù)。

融合率=原生質(zhì)體融合后再生的菌落數(shù)/未經(jīng)滅活的原生質(zhì)體再生菌落數(shù)×100%

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 菌絲體培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 分別采用培養(yǎng) 16、24、32、40、48 h 的菌絲體來(lái)制備原生質(zhì)體，研究其培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響。

1.3.2 甘氨酸對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 在阿維菌素菌絲培養(yǎng)基中加入甘氨酸的濃度分別達(dá)1、2、3、4、5 mg/mL時(shí)，研究甘氨酸對(duì)原生質(zhì)體形成的影響。

1.3.3 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 加入溶菌酶濃度達(dá) 2、3、4、5 mg/mL 時(shí)，28℃酶解 45 min，研究溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響。

1.3.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 在溶菌酶濃度為4 mg/mL，酶解50 min的條件下，分別以26、28、30、32℃不同酶解溫度對(duì)菌絲體進(jìn)行處理，測(cè)定原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率。

1.3.5 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 在溶菌酶濃度為4 mg/mL，酶解溫度為30℃的條件下，對(duì)菌絲體處理 35、40、45、50、55、60 min 不同的酶解時(shí)間，測(cè)定原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

分別采用培養(yǎng) 16、24、32、40、48 h 的菌絲來(lái)制備原生質(zhì)體，培養(yǎng)時(shí)間40 h，形成原生質(zhì)體數(shù)分別為 0.79×107、4.30×107、5.70×107、6.90×107、6.10×107個(gè)/mL。菌絲培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)容易產(chǎn)生黑色素。

2.2 甘氨酸對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

在阿維菌素菌絲培養(yǎng)基中分別加入1、2、3、4、5 mg/mL的甘氨酸后，原生質(zhì)體釋放量分別為4.1×107、4.9×107、5.8×107、7.2×107、6.0×107個(gè)/mL。由試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)加入4 mg/mL甘氨酸時(shí)，原生質(zhì)體釋放量最大。

2.3 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

溶菌酶的濃度應(yīng)該適當(dāng)，過(guò)高或過(guò)低都不利于原生質(zhì)體的形成和再生。如表1所示，當(dāng)加入溶菌酶4 mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體形成數(shù)最大，為5.84×107個(gè)/mL，再生率達(dá)27.2%，原生質(zhì)體制備和再生能得到較好的效果。

表1 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)釋放的影響

2.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

不同的酶具有不同的最適溫度，溫度過(guò)高或者過(guò)低不但對(duì)酶的活性有影響，也會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體活性降低。由表2可知，酶解溫度為30℃，原生質(zhì)體形成數(shù)最大，為 6.23×107個(gè)/mL，再生率達(dá) 29.3%，原生質(zhì)體制備和再生能得到較好的效果。

表2 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)釋放的影響

2.5 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

酶解時(shí)間會(huì)影響原生質(zhì)體的制備和再生。由表3可知，在酶濃度為4 mg/mL，酶解溫度為30℃的條件下，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體的形成量也相應(yīng)增加。當(dāng)酶解時(shí)間為50 min時(shí)，原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率都達(dá)到一個(gè)較佳結(jié)果，因此試驗(yàn)選用酶解時(shí)間為50 min。

表3 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)釋放的影響

2.6 PEG相對(duì)分子量及濃度對(duì)融合率的影響

原生質(zhì)體融合是生物體相互結(jié)合的復(fù)雜過(guò)程，其融合效率受到融合劑種類、融合劑分子量等許多因素的影響。當(dāng)PEG相對(duì)分子量分別為800、1 000、2 000、4 000、6 000 ，濃度為 40%時(shí)，鏈霉菌原生質(zhì)體融合率分別10.1%、13.8%、12.9%、12.6%、13.3%。不添加PEG的融合率為0，PEG 1 000做融合劑時(shí)融合效率最高。融合率與PEG濃度也有很大的關(guān)系。高濃度的PEG不僅引起原生質(zhì)體皺縮，而且有毒性，影響原生質(zhì)融合體的再生。當(dāng)PEG 1 000的濃度分別為0、20%、30%、40%、50%、60%時(shí)，原生質(zhì)體融合率分別為 0、12.6%、14.1%、13.8%、15.5%、13.0%。當(dāng)PEG 1 000濃度為50%時(shí)，融合率最高，因此試驗(yàn)采用的PEG濃度為50%。

3 結(jié)論

阿維菌素（avermectins）是由阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）發(fā)酵產(chǎn)生的是一組高效、低毒、廣譜的殺蟲抗生素，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中有良好的應(yīng)用，并且具有廣闊的市場(chǎng)前景。研究結(jié)果表明，工業(yè)阿維鏈霉菌Z1原生質(zhì)體制備再生的最佳條件為：在250 mL三角瓶裝35 mL含0.5%甘氨酸的YEME培養(yǎng)基中，孢子懸液接種，28℃、200 r/min培養(yǎng) 40 h；3 000 r/min收集菌絲體，并用濃度為10.3%蔗糖溶液清洗2次；在溶菌酶濃度為4 mg/mL的P緩沖液懸浮菌絲體，30℃下酶解50 min，原生質(zhì)體制備完成。原生質(zhì)體在PEG 1 000濃度為50%時(shí)，融合率最高。

[1]Omura S,Ikeda H,Ishikawa J,et al.Geome sequence of an industrial microorganism Streptomyces avermitilis:deducing the ability of producing secondary metabolites[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:12215-12220.

[2]Ikeda H,Ishiawa J,Hanamoto A,et al.Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis[J].Nat Biotechnol.2003,21:526-531.

[3]朱蓓蕾，李俊鎖.阿維菌素類藥物的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，31（6）：520-529.

[4]張 毅.阿維菌素高產(chǎn)菌株的選育 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.