鰱魚蛋白質(zhì)酶水解最佳工藝條件的研究

劉永樂，李向紅，陳志軍，王發(fā)祥，王建輝，俞 健

（長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410014）

我國是淡水資源大國，淡水魚產(chǎn)量一直居世界前位。湖南省是水產(chǎn)大省，全省有水面136.2萬hm2，內(nèi)陸水域面積居全國第3位，2008年全省水產(chǎn)品總產(chǎn)量達到207.3萬t，淡水魚產(chǎn)量排全國第4位，漁業(yè)總產(chǎn)值162.9億元，占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的6.7%，淡水魚是僅次于水稻和生豬的大宗農(nóng)產(chǎn)品。但目前湖南省漁業(yè)產(chǎn)業(yè)狀況仍不容樂觀，鰱魚、草魚、鳙魚等較低價值魚類基本上只能鮮銷[1]，鮮銷過程中腐敗率達30%以上，易導致漁農(nóng)經(jīng)濟收入減少、資源浪費和環(huán)境污染；水產(chǎn)品加工率低，發(fā)達國家的水產(chǎn)品加工率在80%以上，我國淡水魚加工率僅5%左右，而湖南省則不足3%；而且加工深度不夠，初級加工產(chǎn)品依然統(tǒng)領市場，缺少優(yōu)質(zhì)定型產(chǎn)品。因此，研發(fā)低值淡水魚的綜合利用技術，提高產(chǎn)品附加值勢在必行。

目前，魚類水解蛋白因其氨基酸比值與人體肌肉成分近似，而受到人們的普遍關注，酶解后的小分子多肽容易被人體消化吸收，經(jīng)過加工后，魚產(chǎn)品的功能和價值也得到較大的提升[2-5]。當前，人們已經(jīng)開始研究低值小雜魚及魚雜的酶解條件[6-7]。鰱魚作為我國四大家魚之一，具有生長快、質(zhì)量大、細刺少等特點，且飼料來源廣泛，大規(guī)模養(yǎng)殖產(chǎn)量最高。但其肉質(zhì)有些粗糙，口感欠佳，鮮食不太受歡迎。鰱魚的蛋白質(zhì)含量最高可達到26.6%，同時含有豐富的不飽和脂肪酸，有利于血液循環(huán)，經(jīng)常食用具有抗衰老、養(yǎng)顏的功效，對腫瘤也有一定的預防作用[8-11]，因此，鰱魚是水解魚肉蛋白的佳選。試驗以鰱魚為原料，采用復合蛋白酶進行酶解，對其水解工藝的優(yōu)化進行了探索，旨在為提高鰱魚這種低值淡水魚的綜合價值提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚蛋白（實驗室自制）；復合蛋白酶、TNBS試劑（Sigma公司）；標準牛血清白蛋白（上海澤龍生物工程有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（UV-2100型，上海舜宇恒平）；pH計（DELTA 320，上海天普pH計有限公司）；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（天津市泰斯特儀器有限公司）；冷凍離心機（RC-6 Plus，湘儀離心機儀器有限公司）；定時恒溫磁力攪拌器（90-2型，上海精科實業(yè)有限公司）；高速組織搗碎機（武漢市江漢區(qū)圣科儀器設備批發(fā)部）；島津電子分析天平（AUY120，日本島津公司）；真空冷凍干燥機（FD-1，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)成分的測定 蛋白質(zhì)的測定：凱氏定氮法 GB5511-85，N 為 7.24[12]；水分的測定：105℃恒重法GB5512-85；灰分的測定：干法灰化法GB5505-85。

1.3.2 酸溶堿沉法提取魚蛋白的工藝流程 根據(jù)文獻[13-15]采用酸溶堿沉法制備。

稱取一定量的魚肉絞碎，固液比1∶9加水攪拌進組織搗碎機以10 000 r/min搗碎打漿，然后用紗布過濾。濾液在4℃下用酸調(diào)節(jié)ph值至2.40并不斷攪拌90 min；5 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液，將pH值調(diào)至5.40，再次5 000 r/min冷凍離心，得到的沉淀即為提取的粗蛋白，最后將粗蛋白冷凍干燥48小時得到蛋白粉備用。

制備魚蛋白主要工藝流程如下所示：魚肉切碎→加水打漿→加酸攪拌均質(zhì)→離心分離→上清液→堿沉→離心分離→沉淀→ 冷凍干燥→魚肉蛋白。

1.3.3 魚肉蛋白得率及提取率計算

1.3.4 鰱魚蛋白酶解物的制備 按如下流程制備可溶性魚蛋白質(zhì)[16]：

鰱魚蛋白→復合蛋白酶酶解（底物濃度3%、溫度55℃、pH值7.0、時間50 min、酶濃度1%）→滅酶（100℃，10 min）→ 離心（5 000 r/min，20 min）→上清液→濃縮→冷凍干燥→可溶性魚蛋白（魚肽）

2 結(jié)果與分析

2.1 原料鰱魚蛋白的基本成分

采用酸溶、等電沉降法提取鰱魚蛋白，所制備的鰱魚蛋白的基本組成：蛋白含量為75.24%，水分3.85%，灰分3.55，得率69.07%。

2.2 標準曲線的繪制

利用標準牛血清蛋白制作蛋白質(zhì)濃度與吸光值對應關系的標準曲線，即可根據(jù)特定吸光值計算初出樣品液的蛋白質(zhì)濃度，所得標準曲線公式為：y=0.943 x，R2=0.998。

2.3 酶解單因素試驗

以底物濃度（%）、反應時間（t，min）、反應溫度（T，℃）和反應pH值為單因素，以水解液中蛋白濃度為指標分別進行考察。

2.3.1 底物濃度對酶解結(jié)果的影響 配制底物濃度分別為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的蛋白溶液，按 0.1%（E/S）加入酶液，在溫度 55℃，pH 5.5下反應55 min，升溫至90℃加熱10 min終止反應，測定水解液蛋白濃度，結(jié)果如圖1所示。隨著底物濃度增加酶解液中蛋白濃度逐步增大，當?shù)孜餄舛鹊?%后變化趨于平緩，可能是由于底物濃度過大出現(xiàn)產(chǎn)物抑制，故選定2%為最適底物濃度。

圖1 底物濃度對酶水解鰱魚蛋白的影響

2.3.2 反應時間對酶解結(jié)果的影響 濃度為2%的蛋白液等量分成7份，在溫度55℃，pH值5.5下按0.1%（E/S）加入酶液反應。反應時間分別為15、25、35、45、55、65、75 min，結(jié)果如圖 2 所示。隨著反應時間的延長，產(chǎn)物濃度一直在逐漸增大，但在55 min之后增加趨勢不再明顯趨于平緩，從經(jīng)濟性的角度考慮，最后確定55 min為最佳的反應時間。

圖2 反應時間對酶水解鰱魚蛋白的影響

2.3.3 反應溫度對酶解結(jié)果的影響 在考察最適反應溫度的時候其他的條件分別固定為：反應時間為20 min，pH值為5.5，底物濃度1%。由圖3可以看出從30℃到60℃反應上清液中的蛋白濃度先增加后降低，可見復合蛋白酶在催化魚蛋白水解過程中隨著反應溫度的上升活性逐漸增大，增加到一定值后又開始下降是因為酶也是一種蛋白質(zhì)，溫度過高會導致其變性，從而酶活力下降。由于在55℃出現(xiàn)濃度的峰值，說明該酶的最佳反應溫度為55℃。

圖3 反應溫度對酶水解鰱魚蛋白的影響

2.3.4 不同pH值對水解液蛋白質(zhì)濃度的影響在考察最適反應pH值時，其他的條件分別固定為：反應溫度為55℃、底物濃度1%、反應時間55 min。從圖4可看出，pH值對復合蛋白酶水解鰱魚蛋白影響較顯著，在pH值逐步增大的過程中酶解液中蛋白濃度先增大，在pH值7.0時達到最大值，后又迅速下降。故確定pH值7.0為適宜pH值。

圖4 反應pH值對酶水解鰱魚蛋白的影響

2.4 魚蛋白水解條件的正交優(yōu)化法

為了獲得具有較高可溶性氮回收率的魚蛋白水解物，在單因素的基礎上，以反應溫度、反應時間、反應液pH值和底物濃度對水解液可溶性氮回收率（Recovery）為指標，設計4因素3水平來擬合因素和指標之間的函數(shù)關系，采用正交分析法來尋求接枝最優(yōu)工藝參數(shù)。試驗因素的水平見表1，試驗設計和結(jié)果見表2。

從極差分析結(jié)果可以看出，各因素對水解液蛋白質(zhì)濃度影響的主次順序為：C>A>B>D，即pH值>反應溫度>反應時間>底物濃度。最優(yōu)方案為C2A3B3D3。即魚蛋白水解的最佳工藝參數(shù)為pH值7.0、反應溫度55℃、底物濃度3%、反應時間為55 min。

表1 正交試驗的因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果分析

2.5 最佳提取工藝的驗證

稱取魚蛋白粉1.2 g（已經(jīng)按照純度將其折合成純蛋白，能夠達到所需濃度），加pH值7.0的磷酸鹽緩沖液15 mL，后待其加熱到55℃后加入0.5 mL 1%的復合蛋白酶溶液，反應55 min進行驗證試驗。結(jié)果如表3所示。

表3 最佳酶解工藝驗證結(jié)果 （%）

3 結(jié) 論

采用酸溶堿沉法提取魚蛋白，經(jīng)測定，蛋白質(zhì)含量約為75%。以蛋白質(zhì)水解液的蛋白質(zhì)回收率為指標，進行單因素試驗確定了魚蛋白水解的較佳工藝條件，并在單因素試驗結(jié)果的基礎上用正交法對酶解條件進行了優(yōu)化，得到的最佳工藝條件為：反應溫度為55℃，反應時間為55 min，pH值為7.0，底物濃度為3%；優(yōu)化后的水解液蛋白質(zhì)回收率約為50.88%。水解后鰱魚蛋白在廣泛的pH值的范圍內(nèi)均有較好的溶解度，其他功能性質(zhì)也得到不同程度的提高。

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