N端二硫鍵對11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

高樹娟，汪俊卿，鄔敏辰，唐存多，吳靜

1 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶的簡稱，它從木聚糖分子主鏈的內(nèi)部水解β-1,4糖苷鍵，產(chǎn)生不同長度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶[1-2]。其廣泛存在于各種生物體中，目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的是來源于微生物的木聚糖酶[3]?；诿傅鞍滓患壗Y(jié)構(gòu)的同源性比對和疏水簇分析，絕大多數(shù)木聚糖酶屬于糖苷水解酶10和11家族[4]。與10家族的相比，11家族的木聚糖酶具有底物特異性高、分子量低(＜30 kDa)和單一催化結(jié)構(gòu)域等特點[5]。

在紙漿漂白、飼料和生物能源等工業(yè)中需要耐熱木聚糖酶[6-7]，而天然酶往往難以滿足需求，因此，如何提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性已成為廣泛關(guān)注的焦點。楊浩萌等[8]和Sun 等[9]用褐色高溫單胞菌Thermomonospora fusca 耐熱木聚糖酶TfxA 的 N 端分別替換來源于橄欖綠鏈霉菌Streptomyces olivaceoviridis 的木聚糖酶XYNB 和黑曲霉Aspergillus niger 的木聚糖酶AnxA 的對應(yīng)片段，所構(gòu)建的雜合木聚糖酶熱穩(wěn)定性均得到了提高。Fenel 等[10]在瑞氏木霉 Trichoderma reesei 木聚糖酶XYNⅡ的N 端引入一個二硫鍵，其顯著提高了該酶的熱穩(wěn)定性。Wakarchuk 等[11]在環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans 木聚糖酶中構(gòu)建了一個連接N 和C 端的、不影響其酶活性的二硫鍵，使該酶的熱穩(wěn)定性提高了約15℃。

本研究克隆和表達(dá)了一個來自Aspergillus oryzae 的11家族常溫木聚糖酶基因Aoxyn11A。隨后將該基因的5′端序列替換成同一家族耐熱木聚糖酶基因Evxyn11TS[12]的對應(yīng)序列，獲得了雜合木聚糖酶基因AEx11A 并在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。分析和比較了溫度對A.oryzae 木聚糖酶AoXyn11A 和雜合木聚糖酶AEx11A 活性的影響，結(jié)果顯示AEx11A 有較高的最適溫度和熱穩(wěn)定性。最后利用定點突變法證實了引入的N 端二硫鍵(Cys5–Cys32)是影響AEx11A 熱穩(wěn)定性的主要原因之一。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

米曲霉Aspergillus oryzae 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號為CICC40186。大腸桿菌Escherichia coli JM109和DH5α、畢赤酵母Pichia pastoris GS115和表達(dá)載體pPIC9K 為本實驗室保存。克隆載體pUCm-T 購自上海Sangon 公司。根據(jù)耐熱木聚糖酶 EvXyn11TS基因序列(GenBank Accession No.EU591743)，重組載體pUCm-T-Evxyn11TS由本實驗室構(gòu)建和保存。

1.2 工具酶、引物和試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶和Taq 酶等工具酶購自大連TaKaRa 公司；PCR 引物由上海Sangon 公司合成(表1)；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨和 geneticin G418購自上海Sangon 公司；Sephadex G-50凝膠為Amersham Pharmacia Biotech 公司產(chǎn)品；樺木木聚糖和考馬斯亮藍(lán)R-250為Sigma 公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

表1 擴(kuò)增目的基因Aoxyn11A、AEx11A 和AEx11AC5T的PCR 引物Table 1 PCR primers for amplification of target genes Aoxyn11A,AEx11A and AEx11AC5T

1.3 方法

1.3.1 米曲霉木聚糖酶基因重組載體的構(gòu)建

根據(jù) AoXyn11A 基因序列(GenBank Accession No.JQ326257)合成引物 X11-F 和X11-R。以A.oryzae 總RNA 為模板，按照TaKaRa RNA PCR Kit (Ver.3.0)說明書進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化、與pUCm-T 連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送上海Sangon 公司測序。測序正確的重組載體pUCm-T-Aoxyn11A 經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，將目的基因克隆至pPIC9K，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，篩選重組表達(dá)載體 pPIC9KAoxyn11A。

1.3.2 雜合木聚糖酶基因重組載體的構(gòu)建

設(shè)計用EvXyn11TS的N 端42個氨基酸替換AoXyn11A相對應(yīng)的37個氨基酸。根據(jù)Evxyn11TS和Aoxyn11A 序列合成引物Ev-F 和Ev-R。以pUCm-T-Evxyn11TS為模板、Ev-F 和Ev-R 為引物，擴(kuò)增基因片段Ev，作為雜合酶基因AEx11A 的5′端序列；再以pUCm-T-Aoxyn11A 為模板、片段Ev 和X11-R 為引物，采用大引物PCR 法[13]擴(kuò)增全長AEx11A。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析、純化、EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切、與pPIC9K 連接，獲重組表達(dá)載體pPIC9K-AEx11A。

1.3.3 雜合木聚糖酶多模板同源建模

在PDB 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對，尋找到與AEx11A 一級結(jié)構(gòu)同源性較高、分別來源于繩狀青霉菌Penicillium funiculosum (1TE1)、E.coli(2VUL)和紅褐肉座菌Hypocrea jecorina (1ENX)的11家族木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)，作為同源建模的模板。利用 SALIGN (http://salilab.org/DBAli/?page=tools_&action=f_salign)和 MODELLER 9.9(http://salilab.org/modeller/)程序?qū)Ex11A進(jìn)行同源建模[14]。

1.3.4 突變酶基因重組載體的構(gòu)建

為證實因AoXyn11A 的N 端替換所引起的熱穩(wěn)定性提高與引入的N 端二硫鍵(Cys5–Cys32)密切相關(guān)，將AEx11A 基因AEx11A 中Cys5的密碼子突變成同類氨基酸Thr5的密碼子，去除該二硫鍵。以pPIC9K-AEx11A 為模板、C5T-F 和X11-R 為引物，PCR 擴(kuò)增突變酶基因AEx11AC5T。該產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化，EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，與 pPIC9K 連接，獲重組表達(dá)載體pPIC9K-AEx11AC5T。測序結(jié)果表明突變位點與預(yù)期的一致。

1.3.5 木聚糖酶活性的測定

采用改進(jìn)的DNS 法[15]。2.4 mL 0.5%木聚糖溶液(pH 4.6)加入0.1 mL 適當(dāng)稀釋的酶液，50℃下反應(yīng)10 min，加入2.5 mL DNS 試劑，沸水浴中顯色7 min，測定OD540。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol 還原糖所需的酶量定義為一個酶活性單位(U)。

1.3.6 重組木聚糖酶的表達(dá)和純化

pPIC9K-Aoxyn11A、 pPIC9K-AEx11A 和pPIC9K-AEx11AC5T分別用SalⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。電轉(zhuǎn)化及多拷貝轉(zhuǎn)化子篩選方法參見Multi-Copy Pichia Expression Kit (Invitrogen 公司)操作手冊。重組酵母誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析參見文獻(xiàn)[16-17]。表達(dá)上清液用(NH4)2SO4沉淀，離心收集沉淀用緩沖液溶解，透析脫鹽后上Sephadex G-50層析柱。利用Bradford 法[18]測定總蛋白含量。

1.3.7 溫度對木聚糖酶活性的影響

在不同溫度下，按1.3.5方法測定酶活性，以最高酶活性為100%計算相對酶活性。Topt表示最適溫度。將酶液置于不同溫度下保溫不同時間，按1.3.5方法測定殘余酶活性，以未處理的酶活性為100%。t1/2A表示在A ℃下酶的半衰期，即殘余酶活性為50%時的保溫時間。

1.3.8 酶動力學(xué)參數(shù)的測定

以不同濃度的木聚糖溶液(pH 4.6的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制)為底物，在pH 4.6和各種酶的最適溫度條件下測定其活性，按Lineweaver-Burk 法作圖，求出酶的Km和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉木聚糖酶基因重組載體的構(gòu)建

以總RNA 反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA 第一鏈為模板、X11-F 和X11-R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測約在600 bp 處有一條帶，與預(yù)期相符(圖1泳道1)，將目的產(chǎn)物回收純化后，與pUCm-T 連接并測序。結(jié)果表明，目的基因長度為567 bp，編碼188個氨基酸。pUCm-T-Aoxyn11A 和pPIC9K 經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切純化后，相互連接得到重組表達(dá)載體pPIC9K-Aoxyn11A。

2.2 雜合木聚糖酶基因重組載體的構(gòu)建

AoXyn11A 和EvXyn11TS序列的同源性比對顯示它們有66.5%的相似性，但N 端37個氨基酸的同源性僅為40.5%，且EvXyn11TS的熱穩(wěn)定性(80℃下處理60 min 酶活性幾乎不變)遠(yuǎn)高于AoXyn11A，這說明EvXyn11TSN 端可能對其高熱穩(wěn)定性貢獻(xiàn)很大。因此，以AoXyn11A 為母本，設(shè)計將其N 端37個氨基酸替換成EvXyn11TS相對應(yīng)的42個氨基酸，構(gòu)建出雜合木聚糖酶AEx11A。

以pUCm-T-Evxyn11TS為模板，PCR 擴(kuò)增獲得長度約為150 bp 的目的片段Ev (圖1，泳道2)；再以pUCm-T-Aoxyn11A 為模板，獲得約為600 bp的雜合基因AEx11A (圖1，泳道3)。測序結(jié)果表明該AEx11A 長度為582 bp (圖2)。將其克隆至pPIC9K，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-AEx11A。

2.3 雜合酶AEx11A 的結(jié)構(gòu)分析

圖1 Aoxyn11A 和AEx11A 的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Aoxyn11A and AEx11A.M:DNA marker;1:PCR product of Aoxyn11A;2:PCR product of fragment Ev;3:PCR product of AEx11A.

圖2 AEx11A 核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列(下劃線處的氨基酸為AoXyn11A 被EvXyn11TS的N 端所替換的42個氨基酸)Fig.2 Nucleotide sequence of AEx11A and its deduced amino acid sequence.The 42 amino acids underlined are from EvXyn11TS and the others from AoXyn11A.

圖3 雜合木聚糖酶AEx11A 的分子模型Fig.3 Molecular model of hybrid xylanase AEx11A.The β-strands A1–A3 and B1–B2 are from EvXyn11TS.One disulfide bridge (Cys5–Cys32) between β-strands A1 and A2 was introduced into AEx11A resulted from N-terminus substitution.Two catalytic residues (Glu89 and Glu180) locate at the centre of the active region.

通過序列的同源性比對，AEx11A 與來源于P.funiculosum、E.coli 和H.jecorina 的木聚糖酶的相似性分別為63.7%、78.8%和60.9%。AEx11A 的多模板同源建模結(jié)果符合11家族木聚糖酶的結(jié)構(gòu)特征(圖3)。該酶整體呈現(xiàn)右手半握形狀，主要由1個短的α螺旋和2個由15個β折疊股構(gòu)成的、反向平行的A 和B β折疊片構(gòu)成，其中B 折疊片扭曲成兩層形成一個至少可容納4個木糖的巨大裂縫，α螺旋則位于B 折疊片的背部。A 和B 折疊片形成了“手指”結(jié)構(gòu)，α螺旋和部分B 折疊片組成了“手掌”，由4個殘基形成連接2個β折疊片的環(huán)狀結(jié)構(gòu)稱為“拇指”。彎曲的B 折疊片，“核心”區(qū)和“拇指”區(qū)形成了圓筒狀的活性區(qū)域，AEx11A 的催化殘基Glu89和Glu180位于該區(qū)域的中心。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)由于N 端替換，在AEx11A 分子結(jié)構(gòu)中引入了一個二硫鍵(Cys5–Cys32)，其連接2個反向平行的β-折疊股(A1和A2)，可能會通過降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)的熵，而對其熱穩(wěn)定性提高有一定的作用[19]。

2.4 重組木聚糖酶的表達(dá)和純化

經(jīng)1%(V/V)甲醇為碳源誘導(dǎo)重組畢赤酵母72 h 后，離心測發(fā)酵上清液的酶活性，篩選出木聚糖酶AoXyn11A 和AEx11A 表達(dá)量最高的重組子，其酶活性分別達(dá)到263.5 U/mL 和82.2 U/mL。將AoXyn11A 和AEx11A 表達(dá)量最高的酵母重組子的發(fā)酵上清液分別經(jīng)硫酸銨沉淀、透析袋脫鹽和分子篩純化，得到電泳純的目的蛋白。根據(jù)純化酶SDS-PAGE 檢測結(jié)果(圖4，泳道1和2)，估算產(chǎn)物的純度可達(dá)95%以上，其中AoXyn11A 的條帶為24.6 kDa (圖4，泳道1)，大于理論值20.04 kDa，因為其不含有N 糖基化位點，所以推測在酵母中表達(dá)時發(fā)生了O-糖基化，導(dǎo)致分子量增大；AEx11A 序列中含有一個潛在的N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr，X 為除Pro 外任意氨基酸)，使得酵母表達(dá)的木聚糖酶產(chǎn)物的分子量由20.81 kDa 提高到26.2 kDa (圖4，泳道2)。在pH 4.6和各自最適溫度條件下測得AoXyn11A和AEx11A比酶活分別為3008.2 U/mL和1914.3 U/mg。突變酶AEx11AC5T無論是在分子量還是在比酶活上，均與原酶AEx11A 基本一致。

圖4 畢赤酵母表達(dá)的木聚糖酶 AoXyn11A 和AEx11A 的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of AoXyn11A and AEx11A expressed in Pichia pastoris GS115.M:protein marker;1,2:the purified xylanases AoXyn11A and AEx11A,respectively.

2.5 溫度對木聚糖酶活性的影響

各種木聚糖酶最適溫度(Topt)的測定結(jié)果如圖5A 所示。由圖5A 可見，AEx11A 的最適溫度為75℃，比AoXyn11A 的50℃升高了25℃；而AEx11AC5T的最適溫度降為60℃。由此得出結(jié)論：N 端替換顯著地提高了木聚糖酶的最適溫度，其中N 端二硫鍵的引入起到了重要的作用。

各種木聚糖酶熱穩(wěn)定性(t1/2A)的測定結(jié)果如圖5B、C 和D 所示。由圖5B 可見，AoXyn11A的熱穩(wěn)定性較差，50℃下保溫30 min 相對酶活性僅為20%左右，在70℃下的半衰期t1/270僅為1 min，保溫5 min 后酶活性完全喪失。由圖5C可見，AEx11A 在70℃相當(dāng)穩(wěn)定，在該溫度下處理30 min 相對酶活性仍高達(dá)90%，其t1/270延長到了197 min，熱穩(wěn)定性較AoXyn11A 提高了197倍。由圖5D 可見，AEx11AC5T的t1/270和t1/280分別由突變前的197 min和25 min縮短為3.0 min和1.0 min。由此得出結(jié)論：N 端替換顯著地提高了木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，但二硫鍵的去除顯著降低了酶的熱穩(wěn)定性，表明N 端二硫鍵的引入是AEx11A 具有高熱穩(wěn)定性的主要原因之一。

圖5 木聚糖酶AoXyn11A、AEx11A 和AEx11AC5T最適溫度和熱穩(wěn)定性比較Fig.5 Effect of temperature on the xylanase activity.(A) Comparison of the temperature optimum.(B?D) Comparison of the thermostability of AoXyn11A,AEx11A and AEx11AC5T,respectively.

2.6 酶動力學(xué)參數(shù)的測定

在1.0～10 mg/mL 木聚糖濃度下，測得AoXyn11A 的Km和Vmax值分別為1.67 mg/mL 和3805.4 U/mg；與AoXyn11A 相比，AEx11A 的Km值為1.86 mg/mL，變化不大，但其Vmax值降為2412.3 U/mg；AEx11AC5T的Km和Vmax值與原酶AEx11A 基本相同。

3 討論

近年來，一些極端微生物所產(chǎn)的耐熱和耐酸/堿性木聚糖酶已引起了人們的廣泛關(guān)注，但是常規(guī)的菌種選育方法難以達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程的迅速發(fā)展，通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段，按照人類的需求，開發(fā)性質(zhì)優(yōu)異的木聚糖酶已成為可能。木聚糖酶普遍存在著與催化功能無關(guān)的結(jié)構(gòu)域，如熱穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域，許多研究結(jié)果表明11家族木聚糖酶的N 末端區(qū)域?qū)ζ浞€(wěn)定性起著很重要的作用[20]。Lee 等[21]對木聚糖酶XynA 的N 端進(jìn)行刪除突變，突變酶的熱穩(wěn)定性喪失但活性不變，從而確定了N 端是其熱穩(wěn)定區(qū)。同時二硫鍵的添加對木聚糖酶的熱穩(wěn)定性有一定的作用，初步推測，其可能因增強(qiáng)酶蛋白結(jié)構(gòu)域的剛性，使酶的結(jié)構(gòu)緊湊，從而提高熱穩(wěn)定性。

本實驗將米曲霉木聚糖酶的N 端37個氨基酸替換成嗜熱木聚糖酶突變子的相應(yīng)序列，改造后的酶最適溫度為75℃，比天然型酶高出25℃，且熱穩(wěn)定性提高了近200倍。經(jīng)同源建模分析發(fā)現(xiàn)由于N 端替換，在AEx11A N 端的2個β折疊股之間引入了一個二硫鍵(Cys5–Cys32)，推測其熱穩(wěn)定性的提高與此二硫鍵有很大的關(guān)系。一般來說所有的二硫鍵在蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性方面都起著關(guān)鍵的作用，且與蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性密切相關(guān)[22]。本研究利用定點突變法去除AEx11A N端二硫鍵后，其最適溫度和熱穩(wěn)定性明顯降低，由此證實該二硫鍵是影響AEx11A熱穩(wěn)定性的主要原因之一。

目前在許多工業(yè)生產(chǎn)中都需要熱穩(wěn)定性較好的木聚糖酶。動物飼料的原材料如玉米、小麥和農(nóng)副產(chǎn)品等都含有大量的木聚糖，在生產(chǎn)中一般通過添加木聚糖酶來降低飼料的抗?fàn)I養(yǎng)作用及粘度，從而降低飼料成本和提高動物的生產(chǎn)性能[23]，而飼料加工一般要經(jīng)過短暫的高溫制粒(～80℃)。為了提高紙漿的白度，改善紙張性能，降低化學(xué)物質(zhì)用量對環(huán)境的污染[24]，通常利用木聚糖酶對紙漿進(jìn)行預(yù)漂白處理(～60℃)。本實驗構(gòu)建和表達(dá)的雜合酶AEx11A，其優(yōu)質(zhì)的耐高溫特性，有利于擴(kuò)大木聚糖酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用。

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