表達(dá)O型口蹄疫病毒保護(hù)性抗原表位重組PRRSV的構(gòu)建及其鑒定

童武，徐彥召，周艷君，姜一峰，張善瑞，王亞欣，朱建平，虞凌雪，孫晶，陳煥春，童光志

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 2002412 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070

表達(dá)O型口蹄疫病毒保護(hù)性抗原表位重組PRRSV的構(gòu)建及其鑒定

童武1,2，徐彥召1，周艷君1，姜一峰1，張善瑞1，王亞欣1，朱建平1，虞凌雪1，孫晶1，陳煥春2，童光志1

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241
2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070

童武, 徐彥召, 周艷君, 等. 表達(dá)O型口蹄疫病毒保護(hù)性抗原表位重組PRRSV的構(gòu)建及其鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2012,28(12): 1431?1440.

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以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗的感染性分子克隆 (rHuN4-F112) 作為載體，將 O型口蹄疫病毒 (FMDV)VP1基因的421～480nt (141～160aa) 和598～639nt (200～213aa) 兩優(yōu)勢(shì)保護(hù)性抗原表位串聯(lián)成的目的基因，通過(guò)突變PCR的方法插入Nsp2中的508～532位缺失區(qū)域，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中培養(yǎng)36 h，將上清接種至MARC-145細(xì)胞中培養(yǎng)，并在MARC-145細(xì)胞中連續(xù)傳代，拯救重組病毒。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，MluⅠ酶切及測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明插入的外源基因及人為突變的MluⅠ分子標(biāo)記都正確，說(shuō)明重組病毒拯救成功，且該重組病毒能夠在MARC-145細(xì)胞中穩(wěn)定傳代，將此重組病毒命名為rPRRSV-F112-O/VP1ep。rPRRSV-F112-O/VP1ep能夠在MARC-145細(xì)胞上引起明顯的細(xì)胞病變，間接免疫熒光檢測(cè)表明外源基因在該病毒中成功獲得了表達(dá)。經(jīng)過(guò)生物學(xué)特性分析，該病毒的TCID50=-log10-6.75/0.1 mL, 且在MARC-145細(xì)胞中整體生長(zhǎng)速度與其親本病毒rHuN4-F112(△508-532) 相似，但明顯高于rHuN4-F112病毒。

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，O型口蹄疫病毒，感染性分子克隆，重組病毒

口蹄疫 (FMD) 是由口蹄疫病毒 (FMDV)引起的一種烈性傳染病，該病主要感染豬、牛、羊等重要偶蹄動(dòng)物。由于FMDV的危害性極大，暴發(fā)該病不僅給發(fā)病國(guó)家或地區(qū)的畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且還會(huì)引起一系列政治和社會(huì)問(wèn)題。FMDV共分為7個(gè)血清型，各血清型之間交叉保護(hù)性極差，且不同血清型的亞型和分離株間抗原的差異性很大。目前，對(duì)于口蹄疫的預(yù)防主要以免疫接種為主，常用口蹄疫疫苗主要有滅活疫苗、合成肽疫苗兩種[1-2]。1982年 Bittle等首次用化學(xué)合成的方法，合成FMDV VP1蛋白基因上的第141～160位和200～213位氨基酸短肽免疫動(dòng)物成功獲得了保護(hù)[3]。Morgan等分別采用原核表達(dá)的方法，成功表達(dá)了FMDV A12株VP1蛋白基因上的第137～168位氨基酸的二聚體及單體，將這2種融合蛋白分別免疫動(dòng)物，都能成功獲得保護(hù)，且二聚體的保護(hù)效果較單體好[4]。

豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS) 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV) 引起的以懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，仔豬呼吸道疾病為主要特征的一種傳染病[5-7]。2006年南方大部分省市爆發(fā)的以高致病性PRRSV為主要病原的“高熱病”給我國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)帶來(lái)了巨大的損失[8-12]。由于PRRSV能使豬體產(chǎn)生免疫抑制，PRRSV疫苗和FMDV疫苗同時(shí)免疫時(shí)，會(huì)導(dǎo)致FMDV疫苗免疫失敗，利用PRRSV作為載體開(kāi)發(fā)新型的PRRS-FMD二聯(lián)疫苗將可以有效解決這一問(wèn)題。方瑩等在PRRSV感染性分子克隆的基礎(chǔ)上，在Nsp2的非必需區(qū)中插入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP) 序列，拯救重組病毒，結(jié)果顯示能夠成功拯救出含有EGFP基因的重組病毒，但隨著子代病毒在細(xì)胞上的傳代，EGFP基因序列發(fā)生了突變及缺失，進(jìn)而喪失了EGFP活性[13-16]。徐彥召等在PRRSV HuN4-F112疫苗株的反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上，選擇抗原性強(qiáng)的NDVNP49基因作為標(biāo)記基因，成功構(gòu)建了含有標(biāo)記基因的PRRSV的感染性克隆并拯救出病毒，且拯救出的子代病毒在細(xì)胞上能穩(wěn)定地傳代[17-18]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們將 FMDV VP1基因上的141～160位和200～213位氨基酸的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞表位經(jīng) (G4S)2串聯(lián)后插入 PRRSV感染性分子克隆rHuN4-F112(508△-532)[19]中的Nsp2缺失區(qū)，希望可以拯救出含有口蹄疫病毒保護(hù)性抗原表位的重組PRRSV。

1 材料與方法

1.1 試劑

PRRSV HuN4-F112的感染性分子克隆由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[20-21]；抗PRRSV核衣殼 (N) 蛋白的單抗 (鼠源)[22-23]，由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；FMDV typeO VP1 141～160，200～213的多克隆抗體 (豬源) 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)；RNeasy Plus Mini Kit試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，膠回收試劑盒，提質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自上海華舜生物科技有限公司；DpnⅠ，PacⅠ，ClaⅠ，SwaⅠ及T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠 (Alexa Fluor 568) 和羊抗豬 (Alexa Fluor 488) 熒光抗體，RNA轉(zhuǎn)染試劑DMRIE-C reagent購(gòu)自Invitrogen公司；PfuUItra 11 Fusion HS DNA聚合酶購(gòu)自Stratagene公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 mMessage High Yield Capped RNA Transcription Kit購(gòu)自Ambion公司。

1.2 插入FMDV基因片段的引物設(shè)計(jì)及目的基因獲得

參照PRRSV F112核苷酸序列，在插入位置兩端設(shè)計(jì)了一對(duì)鑒定引物P2701和P3192。結(jié)合NCBI中提交部分的FMDV type OVP1基因的全序列，經(jīng)DNAstar軟件比對(duì)并輸出共有序列，然后再分別截取共有序列中的 141～160，200～213位氨基酸殘基的核苷酸序列經(jīng) (G4S)2串聯(lián)后共同組成插入的外源基因序列，大小為132 bp。外源基因序列加上插入位置兩端各20 bp組成目的基因序列，大小為172 bp。設(shè)計(jì)了OUP1、ODP2、ODP3、ODP4、ODP5五條引物，采用PCR的方法對(duì)目的基因進(jìn)行拼接。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 含有外源基因的 rHuN4-F112-ABC(△508-532) 重組質(zhì)粒的獲得

將上述得到的 FMDV外源基因片段采用突變 PCR的方法插到 rHuN4-F112 Nsp2(508△-532)[19]處。突變PCR的反應(yīng)體系：10×PfuUItra 11 反應(yīng)緩沖液 5 μL；dNTPs (10×) 1.25 μL；rHuN4-F112-ABC (508△-532)[19]質(zhì)粒需換算(5～30 ng)；外源基因 1 μL (10 μmol/L 左右)；PfuUItra 11 Fusion HS DNA聚合酶1 μL；補(bǔ)水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：92 ℃2 min；92 10℃ s，55 20℃ s，68 7℃ min 30 s，22個(gè)循環(huán)；68 5℃min；4 ℃保存。將突變 PCR反應(yīng)液用DpnⅠ37 ℃酶切6 h，轉(zhuǎn)化至K12感受態(tài)涂含氨芐平板中培養(yǎng)，挑陽(yáng)性菌測(cè)序驗(yàn)證，并提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 目的基因的擴(kuò)增引物及鑒定引物Table 1 Primers for amplification and identification of target gene

1.4 含外源基因的rHuN4-F112(△508-532)全長(zhǎng)cDNA連接

將上述提取的含 FMDV外源基因片段的rHuN4-F112-ABC (508△-532)[19]質(zhì)粒和rHuN4-F112-DEF[20]質(zhì)粒分別用PacⅠ和ClaⅠ雙酶切后，用華舜的膠回收試劑盒回收相應(yīng)的基因片段，并用 T4 DNA連接酶連接成含外源基因的rHuN4-F112(508△-532)[19]cDNA全長(zhǎng)質(zhì)粒。并用SwaⅠ將含外源基因的rHuN4-F112(△508-532)cDNA全長(zhǎng)質(zhì)粒線性化。

1.5 重組病毒的體外轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)染

根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成重組病毒RNA；并參照DMRI-C reagent轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明將轉(zhuǎn)錄合成的 RNA轉(zhuǎn)染至 70%～90%單層的BHK-21細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染24～36 h取細(xì)胞上清液接種至MARC-145細(xì)胞，觀察CPE，并連續(xù)傳代[24]。

1.6 rPRRSV-F112-O/VP1ep的鑒定及其生物學(xué)特性分析

1.6.1 rPRRSV-F112-O/VP1ep中外源基因及分子標(biāo)記的鑒定

分別提取拯救病毒的第 3、5、10、15、20代毒的RNA利用鑒定引物P2701、P3192及實(shí)驗(yàn)室保存的MluⅠ鑒定引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將MluRTⅠ-PCR產(chǎn)物用MluⅠ酶切，并電泳觀察結(jié)果；同時(shí)把P2701、P3192 RT-PCR反應(yīng)液用P2701引物送公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.6.2 間接免疫熒光 (IFA) 鑒定

將拯救病毒的第 5代毒和其親本毒接種MARC-145細(xì)胞后48 h后棄培養(yǎng)液。用80%預(yù)冷的乙醇 4 ℃固定 1 h，用 1∶500稀釋的抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體為一抗，以FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體為二抗檢測(cè)拯救的重組病毒。同時(shí)用1∶180稀釋的FMDV typeO VP1 141～160，200～213的多克隆抗體孵育1 h，再用FITC標(biāo)記羊抗豬抗體來(lái)反應(yīng)。置熒光顯微鏡下觀察。

1.6.3 rPRRSV-F112-O/VP1ep的TCID50測(cè)定

預(yù)先將MARC-145細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至單層，再將拯救病毒第 5代毒進(jìn)行10-1～10-10十倍倍比稀釋，分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度接種8孔，最后兩列孔不接毒作對(duì)照，置于 37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h后觀察CPE，按照Reed-Muench法計(jì)算重組病毒的TCID50[24]。

1.6.4 rPRRSV-F112-O/VP1ep的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

以第 5代拯救病毒和其親本毒都以 100個(gè)TCID50的毒量接種 MARC-145細(xì)胞，分別在接毒后不同的時(shí)間點(diǎn) (12、24、36、48、60、72、84、96 h) 收取細(xì)胞上清液，分別進(jìn)行病毒的TCID50測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制成曲線[24]。

2 結(jié)果

2.1 rPRRSV-F112-O/VP1ep全長(zhǎng) cDNA的構(gòu)建

利用引物 (OUP1，ODP2，ODP3，ODP4，ODP5) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得172 bp的目的基因片段 (圖1)。采用突變PCR的方法獲得了含F(xiàn)MDV type OVP1兩優(yōu)勢(shì)表位的重組rHuN4-F112-ABC(508△-532) 的質(zhì)粒，用鑒定引物P2701和P3142鑒定，插入后擴(kuò)增的片段大小為549 bp (圖2)。用PacⅠ和ClaⅠ雙酶切并拼接成含F(xiàn)MDV type OVP1兩優(yōu)勢(shì)表位的全長(zhǎng)rHuN4-F112(△508-532)質(zhì)粒。最后用SwaⅠ將該重組的全長(zhǎng)質(zhì)粒線性化。

2.2 rPRRSV-F112-O/VP1ep所引起的細(xì)胞病變

將線性化好的重組質(zhì)粒根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成重組病毒 RNA；并參照 DMRI-C reagent轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明將轉(zhuǎn)錄合成的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染24～36 h取細(xì)胞上清液接種至 MARC-145細(xì)胞，連續(xù)傳代，在MARC-145細(xì)胞在傳至第2代時(shí)就出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變 (圖3)。

圖1 目的基因的獲得Fig. 1 PCR amplification of target gene. M:DL-2000DNA maker; 1: target gene of FMDV; 2: mock.

圖2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 2 Construction of recombinant plasmid. M:DL-2000DNA maker; 1: size of recombinant plasmid; 2:size of r HuN4-F112-ABC (△508-532); 3: mock.

圖3 rPRRSV-F112-O/VP1ep引起的MARC-145細(xì)胞病變Fig. 3 MARC-145 cells infected with PRRSV-F112-O/VP1ep. (A) MARC-145 cells infected with rPRRSV-F112-O/VP1ep virus. (B) Normal MARC-145 cells.

2.3 rPRRSV-F112-O/VP1ep中外源基因及分子標(biāo)記的鑒定

提取第3、5、10、15、20代rPRRSV-F112-O/VP1ep的 RNA經(jīng) P2701、P3192及MluⅠ鑒定引物進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增，鑒定結(jié)果均成立(圖 4，5)。并將第 3、5、10、15、20代重組病毒的RT-PCR反應(yīng)液送測(cè)序，比對(duì)結(jié)果證明其外源基因都穩(wěn)定存在 (圖6)。

圖4 拯救病毒的RT-PCR鑒定Fig. 4 Identification of rescued PRRSV by RT-PCR.M: DNA maker DL-2000; 1?5: RT-PCR of rPRRSVF112-O/VP1ep at 3th, 5th, 10th, 15th, 20th passage; 6:RT-PCR of r HuN4-F112(△508-532); 7: mock.

圖5 拯救病毒及野生型病毒的Mlu Ι酶切鑒定Fig. 5 RT-PCR products of rescued virus and wild type virus digested with Mlu Ι. M: DNA marker DL-2000;1?5: RT-PCR of rPRRSV-F112-O/VP1ep at 3th, 5th, 10th,15th, 20th passage digestion with Mlu Ι; 6: RT-PCR of wild type virus digestion with Mlu Ι; 7: mock.

圖6 rPRRSV-F112-O/VP1ep第3、5、10、15、20代毒外源基因測(cè)序結(jié)果Fig. 6 Sequence determination of inserts in rPRRSV-F112-O/VP1ep at 3th, 5th, 10th, 15th, 20th passage.

2.4 rPRRSV-F112-O/VP1ep的IFA鑒定

將rPRRSV-F112-O/VP1ep的第 5代毒和其親本毒以100個(gè)TCID50的毒量接種MARC-145細(xì)胞48 h后棄培養(yǎng)液。都能與1∶500稀釋的抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體結(jié)合，且都出現(xiàn)了特異性的熒光，rPRRSV-F112-O/VP1ep也能與1∶180稀釋的 FMDV typeO VP1 141～160，200～213的多克隆抗體反應(yīng) (圖7)。

圖7 rPRRSV-F112-O/VP1ep及其親本毒的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 IFA detection of rPRRSV-F112-O/VP1ep and its parental viruses. IFA detection was performed on MARC-145 cells infected respectively, with rHuN4-F112 (A, E), rHuN4-F112(△508-532) (B, F), or rPRRSV-F112-O/VP1ep (C,G) using antibodies against PRRSV N protein (A, B, C, D) or FMDV vp1 protein (E, F, G, H). (D) and (H) are normal MARC-145 cells without infection.

2.5 rPRRSV-F112-O/VP1ep生長(zhǎng)滴度測(cè)定

將 rPRRSV-F112-O/VP1ep第 5代毒進(jìn)行10-1～10-10十倍倍比稀釋，接至96孔MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度接種8孔，留兩列作對(duì)照，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h后觀察CPE，按照Reed-Muench法計(jì)算rPRRSVF112-O/VP1ep 的 TCID50=?log10?6.75/0.1 mL。

2.6 rPRRSV-F112-O/VP1ep的生長(zhǎng)曲線繪制

以第5代rPRRSV-F112-O/VP1ep和其親本毒都以 100個(gè) TCID50的毒量接種 MARC-145細(xì)胞，分別在接毒后不同的時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞上清液，分別進(jìn)行病毒的 TCID50測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制成曲線。結(jié)果顯示重組病毒在MARC-145細(xì)胞中的生長(zhǎng)速度明顯高于其親本毒 (圖 8)。

3 討論

圖8 重組病毒rPRRSV-F112-O/VP1ep及其親本毒在MARC-145細(xì)胞上的多步生長(zhǎng)曲線Fig. 8 Growth curve detection of rPRRSV-F112-O/VP1ep and its parental viruses on MARC-145 cells.

現(xiàn)今臨床中所用的 FMDV疫苗主要還是滅活疫苗和合成肽疫苗[1-2]，由于PRRSV能使豬體產(chǎn)生免疫抑制，PRRSV疫苗和FMDV疫苗同時(shí)免疫時(shí)，會(huì)導(dǎo)致 FMDV疫苗免疫失敗，利用PRRSV作為載體開(kāi)發(fā)新型的PRRS-FMD二聯(lián)疫苗也是很有意義的一項(xiàng)研究。Bittle和Morgan等也都分別證實(shí)了 FMDVVP1基因上的 141～160位和200～213兩表位是FMDV的主要保護(hù)性抗原，能抵抗同源FMDV強(qiáng)毒的攻擊[3-4]。徐彥召等在PRRSV HuN4-F112疫苗株的反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上，選擇抗原性強(qiáng)的NDVNP49基因作為外源標(biāo)記基因，成功構(gòu)建了含有外源標(biāo)記基因的PRRSV的感染性克隆并拯救出病毒，且拯救出的子代病毒中的NP49基因在細(xì)胞上能穩(wěn)定地傳代并獲得表達(dá)。將含NP49的重組 PRRSV接種實(shí)驗(yàn)豬，能夠抵抗PRRSV強(qiáng)毒的攻擊，且能從豬體內(nèi)檢測(cè)到針對(duì)NP49的抗體[17-18]。為PRRSV標(biāo)記疫苗候選株提供了實(shí)驗(yàn)材料，也為本研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗的感染性分子克隆 (rHuN4-F112) 作為載體，采用突變PCR的方法將O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的141～160位和200～213位兩保護(hù)性抗原表位串聯(lián)后，插入到Nsp2中的508～532位缺失區(qū)域，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中培養(yǎng)36 h，將上清接至MARC-145細(xì)胞中連續(xù)傳代，成功拯救出了含 FMDV保護(hù)性抗原的重組病毒。且重組病毒中的外源基因能夠在MARC-145細(xì)胞中穩(wěn)定傳代并得到表達(dá)。為PRRS-FMD二聯(lián)苗提供了候選疫苗株。

本研究驗(yàn)證了PRRSVNsp2的非必需區(qū)的存在，為PRRSV表達(dá)外源基因提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也進(jìn)一步證明了PRRSV對(duì)外源基因的耐受性。為PRRSV標(biāo)記疫苗的研究提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為PRRSV二聯(lián)苗的研究提供了新的方向。

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August 9, 2012; Accepted: October 31, 2012

Guangzhi Tong. Tel:+86-21-34293436; Fax: +86-21-54081818; E-mail: gztong@shvri.ac.cn

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2011AA10A208)，國(guó)際合作項(xiàng)目 (No. 2010DF33920)，中央科研院所公益性基礎(chǔ)科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目 (No. 2011JB03)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31100121)，NSFC-廣聯(lián)合基金項(xiàng)目 (No. U0931003) 資助。

Construction and identification of a recombinant PRRSV expressing protective antigens of type O foot-and-mouth disease virus

Wu Tong1,2, Yanzhao Xu1, Yanjun Zhou1, Yifeng Jiang1, Shanrui Zhang1, Yaxin Wang1,Jianping Zhu1, Lingxue Yu1, Jing Sun1, Huanchun Chen2, and Guangzhi Tong1

1Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai200241,China
2College of Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,Hubei,China

Using mutation PCR, we cloned the target gene containing 421?480nt (141?160aa) and 598-639nt (200?213aa)ofVP1gene of foot and mouth disease virus (FMDV) into the deleted region (508?532aa) ofNsp2gene of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus derived vaccine strain (HuN4-F112) that was used as vector. The recombinant cDNA wasin vitrotranscribed followed by trancfection of BHK-21 cells for 36 h. Then, the supernatant of the cell culture was continuously seeded to monolayer of MARC-145 cells for recovery of the recombinant virus. CPE was obviously visible after a couple of passages in the seeded MARC-145, and the rescued virus (designated as rPRRSV-F112-O/VP1ep) was identified byMluI digestion, sequencing and immunofluorescence assay. Meanwhile,expression of inserted FMDV epitopes was also detected by indirect immunofluorescence assay with polyclonal antibodies against VP1 protein of FMDV. The analysis of biological characteristics shows that the titer of the rescued recombinant PRRSV (TCID50=?log10?6.75/0.1 mL) was similar to its direct parental virus rHuN4-F112-508△-532, but higher than rHuN4-F112.

porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), foot and mouth disease virus of type O, infectious cloning, reorganization of virus

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A208 ) , International Sci &Tech Cooperation Program (No. 2010DFB33920), National Nonprofit Institute Research Grant of CATAS-ITBB (No. 2011JB03), National Natural Science Foundation of China (No. 31100121), NSFC-Guangdong Joint Foundation (No. U0931003).