集胞藻PCC6803膜脂循環(huán)關(guān)鍵基因酶學(xué)性質(zhì)和生理功能

高倩倩，談曉明，呂雪峰,3

1 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 2661012 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 1000493 山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

集胞藻PCC6803膜脂循環(huán)關(guān)鍵基因酶學(xué)性質(zhì)和生理功能

高倩倩1,2，談曉明1，呂雪峰1,3

1 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101
2 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049
3 山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

高倩倩, 談曉明, 呂雪峰. 集胞藻 PCC6803膜脂循環(huán)關(guān)鍵基因酶學(xué)性質(zhì)和生理功能. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(12):1473?1481.

Gao QQ, Tan XM, Lü XF. Characterization of a key gene in membrane lipid cycle inSynechocystissp. PCC6803. Chin J Biotech, 2012, 28(12): 1473?1481.

集胞藻PCC6803野生型和其脂酰ACP合酶敲除突變株的自由脂肪酸含量和組成表明膜脂的重構(gòu)和降解是細(xì)胞內(nèi)自由脂肪酸的來(lái)源之一。在這一過(guò)程中脂肪酶起到關(guān)鍵性作用。通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)集胞藻PCC6803基因組中只有一個(gè)脂肪酶編碼基因sll1969，但是還沒(méi)有其功能相關(guān)的生化證據(jù)。為了確定該基因的功能及其在脂肪酸代謝途徑中的作用，加深對(duì)集胞藻PCC6803脂肪酸代謝途徑的了解，文中將sll1969基因在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)和體外純化，得到重組蛋白Sll1969，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步分析。在30 ℃條件下，測(cè)得Sll1969以對(duì)硝基苯丁酸酯作為底物時(shí)的Km和kcat值分別為 (1.16±0.01) mmol/L和 (332.8±10.0)/min；該脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃。通過(guò)比較分析sll1969突變株中脂肪酸含量和組成變化，發(fā)現(xiàn)sll1969的表達(dá)量與細(xì)胞自由脂肪酸的產(chǎn)量呈正相關(guān)，但Sll1969不是細(xì)胞中唯一的脂肪酶。

脂肪酶，sll1969，對(duì)硝基苯丁酸酯，脂肪酸

面對(duì)日益增長(zhǎng)的能源需求和日益嚴(yán)峻的溫室效應(yīng)問(wèn)題，可再生的環(huán)境友好型的生物能源正逐漸凸顯其巨大的應(yīng)用潛力。脂肪酸族生物燃料因其能量密度高，與現(xiàn)行的運(yùn)輸系統(tǒng)兼容性好等優(yōu)勢(shì)而逐漸受到人們的關(guān)注，關(guān)于脂肪酸族生物燃料在基因工程大腸桿菌的生物合成也成為研究熱點(diǎn)[1-3]。放氧光合微生物藍(lán)細(xì)菌由于具有生長(zhǎng)速度快、遺傳操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)也被用于包括脂肪酸族生物燃料在內(nèi)的多種生物燃料和生物化學(xué)品分子的生物合成研究[4-5]。

Schirmer等首次鑒定了藍(lán)細(xì)菌中的脂肪烴生物合成途徑：脂酰 ACP被脂酰 ACP還原酶(AAR) 還原為脂肪醛，脂肪醛被脂肪醛脫羰基酶(ADC) 催化最終形成脂肪烴[6]。談曉明等通過(guò)在集胞藻PCC6803中表達(dá)不同來(lái)源的脂酰CoA還原酶基因 (far) 實(shí)現(xiàn)了脂肪醇在藍(lán)細(xì)菌的生物合成，最高產(chǎn)量達(dá)到200 μg/L[7]。

藍(lán)細(xì)菌生物合成脂肪醇和脂肪烴等脂肪族生物液體燃料包括兩個(gè)關(guān)鍵步驟：過(guò)量生產(chǎn)脂肪酸和脂肪酸衍生化[4]。為了在藍(lán)細(xì)菌中大量生產(chǎn)脂肪酸，劉欣堯等通過(guò)過(guò)表達(dá)集胞藻 PCC6803本身的脂酰 CoA羧化酶和外源的硫脂酶，以及敲除碳源競(jìng)爭(zhēng)途徑 PHB合成等途徑和細(xì)胞S-layer合成途徑中相關(guān)基因等基因工程改造工作，最終實(shí)現(xiàn)了自由脂肪酸的過(guò)量生產(chǎn)和分泌，最高產(chǎn)量達(dá)到 (197±14) mg/L[8]。隨后，劉欣堯等又通過(guò)條件誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制外源脂肪酶的表達(dá)，使之在產(chǎn)脂肪酸細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)期降解細(xì)胞膜脂，從而進(jìn)一步釋放和提高自由脂肪酸的產(chǎn)量[9]。最近，美國(guó)桑迪亞國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)研究小組也實(shí)現(xiàn)了在另一種藍(lán)細(xì)菌聚球藻 PCC7942中合成和分泌自由脂肪酸[10]。這一系列工作表明基因工程藍(lán)細(xì)菌脂肪族類液體生物燃料產(chǎn)量的提高還有很大的空間。

關(guān)于集胞藻PCC6803脂酰ACP合酶 (aas)突變株的同位素標(biāo)記示蹤實(shí)驗(yàn)表明，集胞藻體內(nèi)存在一個(gè)特殊的自由脂肪酸到膜脂的循環(huán)途徑：即細(xì)胞膜脂能夠被未知的脂肪酶水解，釋放出自由脂肪酸；自由脂肪酸被脂酰 ACP合酶重新激活為脂酰ACP，后者又被?；D(zhuǎn)移酶重新利用而摻入到細(xì)胞膜脂上[11-12]。在這一過(guò)程中，將細(xì)胞膜脂水解為自由脂肪酸的脂肪酶發(fā)揮了重要的生理功能。而鑒定脂肪酶編碼基因和解析該脂肪酶的生理功能，對(duì)進(jìn)一步解析藍(lán)細(xì)菌膜脂循環(huán)途徑的生理功能以及進(jìn)一步提高基因工程藍(lán)細(xì)菌脂肪族生物燃料的產(chǎn)量具有重要的意義。

針對(duì)集胞藻 PCC6803基因組中唯一的脂肪酶候選基因sll1969，本研究開(kāi)展了一系列有關(guān)的體外酶學(xué)表征以及生理功能鑒定工作，最終確定該基因編碼蛋白為脂肪酶，但是它不是集胞藻PCC6803基因組中唯一的脂肪酶基因。

1 材料與方法

1.1 試劑

十九烷酸購(gòu)自Sigma-Aldrich公司 (美國(guó))。其他化學(xué)試劑購(gòu)自Merck公司 (德國(guó)) 或Amresco公司 (美國(guó))。TaqDNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司 (加拿大) 或者TaKaRa公司(日本)。用于分子克隆的試劑盒購(gòu)自 Omega或TaKaRa (日本)。DNA引物在Sangon (中國(guó)上海) 合成。DNA分子標(biāo)記購(gòu)自TaKaRa公司(日本)。

1.2 質(zhì)粒和突變菌株的構(gòu)建

以集胞藻PCC6803基因組DNA為模板，以Sll1969ndes/Sll1969xhoIcas和 Sll1969bglIIs/Sll1969xhochas (表1) 為引物對(duì)，PCR得到兩端帶有不同酶切位點(diǎn)的DNA片段；按照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[13]的方法，分別將這兩個(gè)片段插入表達(dá)載體pET21b (Novagen, 美國(guó))NdeⅠ/XhoⅠ位點(diǎn)和pXT37b[7]的BglⅡ/XhoⅠ位點(diǎn)，分別得到質(zhì)粒pGQ73和pGQ48。

以集胞藻PCC6803基因組DNA為模板，分別利用引物對(duì) 1969kuF/R和 1969kdF/R擴(kuò)增sll1969上下游各500 bp左右的片段，并分別將它們克隆到pMD18-T載體，得到質(zhì)粒pGQ43和pGQ44。以BamHⅠ將質(zhì)粒 pRL446[14]攜帶的的卡那霉素抗性基因片段C.K2切下，插入經(jīng)過(guò)同樣酶切的pGQ43，得到質(zhì)粒pGQ45。之后，pGQ45經(jīng)過(guò)DraⅠ和EcoRⅠ酶切補(bǔ)平后，回收1 700 bp左右的片段，插入經(jīng)過(guò)SmaⅠ酶切的pGQ44，得到質(zhì)粒pGQ46。所有載體構(gòu)建經(jīng)過(guò)酶切或者測(cè)序驗(yàn)證。

鑒定正確的質(zhì)粒pGQ48和pGQ46，參照文獻(xiàn)報(bào)道的轉(zhuǎn)化方法[15]，轉(zhuǎn)化集胞藻PCC6803aas敲除突變株 GQ8[16]后，分別得到菌株 GQ12和GQ13。GQ12轉(zhuǎn)化子用攜帶5 mg/L壯觀霉素和5 mg/L紅霉素的抗性平板篩選得到；GQ13轉(zhuǎn)化子用攜帶5 mg/L卡那霉素和5 mg/L紅霉素的BG11平板篩選得到。整合完全的突變株通過(guò)基因組PCR加以驗(yàn)證。

1.3 蛋白表達(dá)和純化

將構(gòu)建得到的蛋白表達(dá)質(zhì)粒 pGQ73導(dǎo)入到大腸桿菌BL21 (DE3) 中。挑取轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過(guò)液體過(guò)夜培養(yǎng)后，以 1∶100的比例稀釋到新的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。待OD600達(dá)到0.6～0.7時(shí)，加入0.2 mmol/L IPTG，之后轉(zhuǎn)到16 ℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 12 h。離心收集細(xì)胞 (5 000×g，4 ℃，10 min)，收集的細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液(20 mmol/L PBS，0.5 mol/L NaCl，pH 6.9)，冰浴中超聲破碎。破碎完全后，離心 (14 000×g，4 ℃，30 min) 并收集上清。上清液經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上鎳柱純化，純化過(guò)程按照蛋白純化說(shuō)明書 (Novagen) 執(zhí)行。純化得到的蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和 Western blotting驗(yàn)證。Western blotting檢測(cè)采用PVDF膜 (Roch，美國(guó))。利用6×His-標(biāo)簽探針標(biāo)記目的蛋白，最終使用堿性磷酸酶顯色試劑盒 (Amresco，美國(guó)) 進(jìn)行檢測(cè)。蛋白濃度的測(cè)定方法參照Bradford方法[17]。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 脂肪酶活性檢測(cè)

脂肪酶活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[18]進(jìn)行，反應(yīng)體系使用對(duì)硝基苯丁酸酯作為底物。脂肪酶催化底物分解產(chǎn)生對(duì)硝基苯，在此過(guò)程中不斷測(cè)定光吸收值的變化。根據(jù)單位時(shí)間產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚的量來(lái)反應(yīng)酶活力。反應(yīng)A液：3 g/L的對(duì)硝基丁酸酯的異丙醇溶液 (冷藏)，B液含有0.4% TritonX-100和 0.1%阿拉伯樹(shù)膠的0.1 mol/L PBS緩沖液 (pH 7.0)。測(cè)定時(shí)將A、B兩種儲(chǔ)存液按照1∶9的體積比混合。取900 μL混合液加入100 μL適當(dāng)濃度的酶液混勻測(cè)定吸光值 (410 nm) 的變化。在此反應(yīng)條件下對(duì)硝基苯的消光系數(shù)是 1.5×104L/(mol·cm)。

1.5 菌株的培養(yǎng)和自由脂肪酸的提取測(cè)定

集胞藻菌株在 30 ℃條件下進(jìn)行光照培養(yǎng)(30 μE /(m2·s))，突變株 GQ8 在含有 10 mg/L 紅霉素的BG11培養(yǎng)基[19]中培養(yǎng)；突變株GQ12在含有10 mg/L壯觀霉素和10 mg/L紅霉素的BG11中培養(yǎng)；突變株GQ13在含有10 mg/L卡那霉素和10 mg/L紅霉素的BG11中培養(yǎng)。用于自由脂肪酸測(cè)定的菌株于50 mL液體BG11中，搖床培養(yǎng)。收集生長(zhǎng)至平臺(tái)期的或平臺(tái)期后轉(zhuǎn)至42 ℃熱激1 d后的藻細(xì)胞進(jìn)行自由脂肪酸提取和測(cè)定[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的異源表達(dá)、蛋白純化及部分酶學(xué)性質(zhì)分析

經(jīng)過(guò)測(cè)序和酶切鑒定正確的sll1969基因表達(dá)載體 pGQ73 (圖 1)，被導(dǎo)入大腸桿菌 BL21(DE3) 進(jìn)行異源表達(dá)。37 ℃，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h時(shí)，得到的目的蛋白主要以包涵體的形式存在。而采用16 ℃誘導(dǎo)時(shí)，得到的可溶性蛋白含量增加。最終選擇以16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜的細(xì)胞用于蛋白純化。sll1969基因編碼蛋白預(yù)測(cè)分子量為22 kDa，純化的蛋白攜帶His標(biāo)簽預(yù)測(cè)總大小為 23.5 kDa。純化得到的蛋白經(jīng)過(guò) 12%濃度的SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè) (圖2)，與預(yù)測(cè)的蛋白大小基本相符。純化得到的蛋白經(jīng)過(guò)脫鹽和30% PEG20000濃縮后，利用Bradford方法進(jìn)行蛋白定量。最終，在1 L的培養(yǎng)物中共純化得到約2.5 mg蛋白。以對(duì)硝基苯丁酸酯作為底物進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，最終測(cè)得30 ℃條件下該酶Km和kcat值分別為(1.16±0.01) mmol/L 和332.8±10.0/min。酶活性的溫度的依賴性檢測(cè)表明酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃ (圖2)。

2.2 sll1969突變株的構(gòu)建

為了研究脂肪酶 (Sll1969) 在集胞藻PCC6803脂肪酸代謝途徑中的作用，作者分別構(gòu)建了敲除sll1969基因和過(guò)表達(dá)sll1969基因的兩種突變株。首先構(gòu)建了用于sll1969基因敲除的質(zhì)粒 pGQ46和用于sll1969基因過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒pGQ48 (圖 1)。通過(guò)同源重組[15]，質(zhì)粒 pGQ46攜帶的卡那霉素抗性基因能夠替換基因組中的sll1969基因編碼區(qū)；而質(zhì)粒pGQ48攜帶的PpetE啟動(dòng)子[21]驅(qū)動(dòng)的sll1969基因表達(dá)元件將插入到集胞藻PCC6803中性位點(diǎn)slr0168[15]位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)該基因過(guò)表達(dá)。將質(zhì)粒pGQ46和pGQ48分別轉(zhuǎn)化aas敲除突變株GQ8[16]得到菌株GQ13和GQ12。

圖1 本研究構(gòu)建的質(zhì)粒圖Fig. 1 Maps of the plasmids. (A) pGQ73. (B) pGQ46. (C) pGQ48.

因?yàn)樗{(lán)細(xì)菌細(xì)胞包含多拷貝染色體[22]，突變株是否分離完全，需要經(jīng)過(guò)基因組 PCR鑒定(圖3)。過(guò)表達(dá)菌株基因組通過(guò)兩個(gè)PCR反應(yīng)確定基因插入了正確的位置且整合是完全的 (圖3A)。第一個(gè)反應(yīng)使用插入位點(diǎn)的引物 0168-2和插入基因的引物sll1969bglIIs來(lái)證實(shí)基因插入了正確的位點(diǎn)。第二個(gè)反應(yīng)使用插入位點(diǎn)的引物0168-1和0168-2來(lái)檢測(cè)野生型被取代完全。sll1969敲除突變株的基因型檢測(cè)，使用敲除位點(diǎn)外圍引物sll1969bglIIs和 Sll1969xhoIcas來(lái)確定插入是否完全(圖 3B)。PCR結(jié)果顯示該突變株構(gòu)建分離完全。

圖2 SDS-PAGE (A)和Western blotting (B) 檢測(cè)Sll1969蛋白過(guò)表達(dá)及純化及溫度對(duì)酶活力的影響(C)Fig. 2 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) analysis of Sll1969 and effect of temperature on the activity of Sll1969 (C). (A) M: protein marker; 1: cell lysate of E. coli BL21 containing pGQ73; 2: flow through material; 3:effluent of binding buffer with 20 mmol/L imidazole; 4: effluent of binding buffer with 40 mmol/L imidazole; 5:effluent of binding buffer with 60 mmol/L imidazole; 6: effluent of binding buffer with 100 mmol/L imidazole. (B)Western blotting of purified Sll1969. (C) Effect of temperature on the activity of Sll1969.

圖3 雙突變株GQ12和GQ13基因型檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 PCR analysis of the genotype of GQ12 (A) and GQ13 (B). (A) M: DNA marker (DL2000 DNA Ladder Marker); 1: genomic DNA of wild type was amplified by primers 0168-2 and sll1969bglIIs (control); 2: genomic DNA of GQ12 was amplified by the same primers as lane 1; 3: plasmid pGQ48 was amplified by the same primer as lane 1(control); 4: genomic DNA of wild-type was amplified by primers 0168-1 and 0168-2 (control); 5: genomic DNA of GQ12 was amplified by the same primers as lane 4. (B) M: DNA marker (DL2000 DNA Ladder Marker); 1: genomic DNA of wild type was amplified by primers sll1969bglIIs and Sll1969xhoIcas (control); 2: genomic DNA of GQ13 was amplified by the same primers as lane 1; 3: plasmid pGQ46 was amplified by the same primer as lane 1 (control).

2.3 突變株自由脂肪酸組成表明 Sll1969不是集胞藻PCC6803細(xì)胞中唯一的脂肪酶

我們檢測(cè)和分析了sll1969過(guò)表達(dá)突變株GQ12和sll1969敲除突變株GQ13的自由脂肪酸組成和含量的變化 (圖4)。由于體外酶學(xué)性質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)表明該脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，因此在檢測(cè)sll1969過(guò)表達(dá)對(duì)脂肪酸代謝的影響時(shí)，將突變株GQ8和GQ12置于42 ℃熱激后進(jìn)行脂肪酸測(cè)定。

在42 ℃熱激條件下，GQ12和GQ8的自由脂 肪 酸 產(chǎn) 量 分 別 是 (9.2±1.5) mg/(L·OD730)和(6.6±0.5) mg/(L·OD730) (圖 4A)。其中過(guò)表達(dá)sll1969使得脂肪酸含量提高了 40%左右，這表明在這種培養(yǎng)條件下sll1969過(guò)表達(dá)確實(shí)能夠提高膜脂向自由脂肪酸的轉(zhuǎn)化。

而30 ℃培養(yǎng)的sll1969敲除突變株GQ13和出發(fā)菌株 GQ8的自由脂肪酸含量分別為(3.82±0.48) mg/(L·OD730)和(5.09±0.14) mg/(L·OD730)(圖4B)，sll1969敲除以后自由脂肪酸的含量下降了33%左右。這也同樣印證了上面的結(jié)果，sll1969的表達(dá)量與細(xì)胞的自由脂肪酸含量呈正相關(guān)。這與脂肪酶的生理功能是相符合的。值得注意的是，不飽和脂肪酸在兩個(gè)菌株中產(chǎn)量差別不太明顯，GQ13 中的含量是(1.33±0.34) mg/(L·OD730)，GQ8中的含量是(1.88±0.51) mg/(L·OD730)。Sll1969 敲除以后不飽和脂肪酸并沒(méi)有特別明顯減少。

圖4 藻株GQ8與sll1969過(guò)表達(dá)突變株 (GQ12) (A) 和sll1969敲除突變株 (GQ13) (B) 自由脂肪酸產(chǎn)量Fig. 4 Production of free fatty acids of GQ8, GQ12 (A) and GQ13 (B).

3 討論

生物細(xì)胞內(nèi)自由脂肪酸的來(lái)源，一是通過(guò)硫酯酶水解脂肪酸生物合成的產(chǎn)物脂酰ACP生成；二是通過(guò)脂肪酶水解細(xì)胞膜脂而生成。脂酰ACP合酶 (Aas) 敲除突變株自由脂肪酸分析結(jié)果顯示，相對(duì)于野生型，該突變株不飽和自由脂肪酸含量上升[11,16]。而集胞藻PCC6803的脂酰脫飽和酶 (Acyl-lipid desaturase) 的底物為細(xì)胞膜脂[23]，而非脂酰 ACP；細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸側(cè)鏈只有先整合到細(xì)胞膜脂才能被脫飽和。因此，脂酰ACP合酶敲除突變株中不飽和自由脂肪酸含量上升的結(jié)果表明，集胞藻 PCC6803細(xì)胞內(nèi)的自由脂肪酸主要來(lái)源于細(xì)胞膜脂，而不飽和自由脂肪酸的來(lái)源一定是細(xì)胞膜脂。而 Kaczmarzyk等通過(guò)向集胞藻 PCC6803培養(yǎng)液中添加放射性標(biāo)記的乙酸的同位素示蹤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)放射性標(biāo)記首先出現(xiàn)在細(xì)胞膜脂上，然后出現(xiàn)在自由脂肪酸中，這一結(jié)果進(jìn)一步表明細(xì)胞內(nèi)自由脂肪酸來(lái)源于膜脂的水解[11]。

通過(guò)序列同源比對(duì)，集胞藻 PCC6803基因組中的脂肪酶編碼基因只有一個(gè)，即sll1969基因。本研究中sll1969編碼的蛋白的酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果證明這個(gè)基因編碼蛋白為脂肪酶，其最適反應(yīng)溫度為55 ℃。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了sll1969突變菌株中脂肪酸含量和組成，分析了sll1969在脂肪酸代謝中的作用。不同菌株脂肪酸含量和組成對(duì)比表明sll1969基因表達(dá)量與自由脂肪酸產(chǎn)量呈正相關(guān)。但是，sll1969基因敲除突變株GQ13中仍然存在自由脂肪酸，特別是不飽和自由脂肪酸的存在，也提示Sll1969不是集胞藻PCC6803細(xì)胞中唯一的脂肪酶。而對(duì)sll1969基因功能的研究，有助于更清晰地了解藍(lán)細(xì)菌脂肪酸代謝以及利用光合藍(lán)細(xì)菌平臺(tái)生產(chǎn)脂肪酸族生物燃料。

[1]Lu XF, Vora H, Khosla C. Overproduction of free fatty acids inE.coli: implications for biodiesel production. Metab Eng, 2008, 10(6): 333?339.

[2]Steen EJ, Kang YS, Bokinsky G, et al. Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature, 2010,463(7280): 559?562.

[3]Zhang FZ, Carothers JM, Keasling JD. Design of a dynamic sensor-regulator system for production of chemicals and fuels derived from fatty acids. Nat Biotechnol, 2012, 30(4) 354?359.

[4]Lu XF. A perspective: Photosynthetic production of fatty acid-based biofuels in genetically engineered cyanobacteria. Biotechnol Adv, 2010, 28(6):742?746.

[5]Robertson DE, Jacobson SA, Morgan F, et al. A new dawn for industrial photosynthesis. Photosynth Res, 2011, 107(3): 269?277.

[6]Schirmer A, Rude MA, Li XZ, et al. Microbial biosynthesis of alkanes. Science, 2010, 329(5991):559?562.

[7]Tan XM, Yao L, Gao QQ, et al. Photosynthesis driven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons in cyanobacteria. Metab Eng, 2011, 13(2): 169?176.

[8]Liu XY, Sheng J, Curtiss R III. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(17): 6899?6904.

[9]Liu XY, Fallon S, Sheng J, et al.CO2-limitation-inducible green recovery of fatty acids from cyanobacterial biomass. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(17): 6905?69058.

[10]Ruffing AM, Jones HDT. Physiological effects of free fatty acid production in genetically engineeredSynechococcus elongatusPCC 7942. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(9): 2190?2199

[11]Kaczmarzyk D, Fulda M. Fatty acid activation in cyanobacteria mediated by acyl-acyl carrier protein synthetase enables fatty acid recycling. Plant Physiol, 2010, 152(3): 1598?1610.

[12]von Berlepsch S, Kunz HH, Brodesser S, et al. The Acyl-acyl carrier protein synthetase fromSynechocystissp. PCC6803 mediates fatty acid import. Plant Physiol, 2012, 159(2): 606?617

[13]Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press, 2001.

[14]Elhai J, Wolk CP. A versatile class of positive-selection vectors based on the nonviability of palindrome-containing plasmids that allows cloning into long polylinkers. Gene, 1988, 68(1):119?138.

[15]Williams JGK. Construction of specific mutations in photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods inSynechocystis6803.Method Enzymol, 1988, 167: 766?778.

[16]Gao QQ, Wang WH, Zhao H, et al. Effects of fatty acid activation on photosynthetic production of fatty acid-based biofuels inSynechocystissp.PCC6803. Biotechnol Biofuels, 2012, 5(1): 17.

[17]Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72(1/2): 248?254.

[18]Nguyen LN, Dao TT, ?ivkovi? T, et al. Enzymatic properties and expression patterns of five extracellular lipases ofFusarium graminearum in vitro. Enzyme Microb Technol, 2010, 46(6):479?486.

[19]Rippka R, Deruelles J, Waterbury JB, et al. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology, 1979,111(1): 1?61.

[20]Guan WN, Zhao H, Lu XF, et al. Quantitative analysis of fatty-acid-based biofuels produced by wild-type and genetically engineered cyanobacteria by gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr A, 2011, 1218(45): 8289?8293.

[21]Gao H, Tang Q, Xu XD. Construction of copper-induced gene expression platform inSynechocystissp. PCC6803. Acta Hydrobiol Sin,2007, 31(2): 240?244.

高宏, 唐蜻, 徐旭東. 集胞藻 PCC6803銅離子誘導(dǎo)表達(dá)平臺(tái)的構(gòu)建. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(2):240?244.

[22]Griese M, Lange C, Soppa J. Ploidy in cyanobacteria. FEMS Microbiol Lett, 2011, 323(2):124?131.

[23]Murata N, Wada H, Gombos Z. Modes of fatty-acid desaturation in cyanobacteria. Plant Cell Physiol,1992, 33(7): 933?941.

May 4, 2012; Accepted: May 17, 2012

Xuefeng Lü. Tel/Fax: +86-532-80662629; E-mail: lvxf@qibebt.ac.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30970048) 資助。

Characterization of a key gene in membrane lipid cycle inSynechocystissp. PCC6803

Qianqian Gao1,2, Xiaoming Tan1, and Xuefeng Lü1,3

1Key Laboratory of Biofuels,Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao266101,Shandong,China
2Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China
3Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics,Qingdao266101,Shandong,China

Free fatty acid profiles of wild type and fatty acyl-ACP synthase deletion mutant strain ofSynechocystissp.PCC6803 indicated that one origin of these fatty acids is the process of lipid remodeling or lipid degradation. Lipase is the key enzyme involved in this process. The genesll1969is the sole gene encodes a putative lipase inSynechocystissp.PCC6803. To identify the function of this gene and its role in fatty acid metabolism, we cloned thesll1969from genomic DNA, overexpressed it inEscherichia coliBL21 (DE3) using pET expression system and purified this recombinant enzyme with Nickel-nitrilotriacetic acid affinity chromatography. The enzyme activity was assayed by spectrophotometric with p-nitro-phenylbutyrate as substrate. TheKmandkcatof the enzyme is (1.16±0.01) mmol/L and (332.8±10.0)/min,respectively toward p-nitro-phenylbutyrate at 30oC. The optimal temperature of the enzyme is 55oC. To investigate the biological role of Sll1969 in fatty acid metabolism in cyanobacteria, we constructedsll1969deletion and overexpression mutant strains in the background of fatty acyl-ACP synthase deletion mutant ofSynechocystissp. PCC6803. The analyses of the content of free fatty acids in different mutant strains showed that the contents of Sll1969 and free fatty acid are positively correlated. The free fatty acid profiles of thesll1969mutant strains suggested this enzyme is not the sole enzyme for degrading lipid inSynechocystissp. PCC6803.

lipase,sll1969, p-nitro-phenylbutyrate, fatty acid

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30970048).