大黃魚三種病原弧菌外膜蛋白交叉保護(hù)性抗原篩選

張崇文，毛芝娟，于漣

1 上海市水產(chǎn)研究所，上海 2004332 浙江萬里學(xué)院，浙江 寧波 3151003 浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058

大黃魚三種病原弧菌外膜蛋白交叉保護(hù)性抗原篩選

張崇文1，毛芝娟2，于漣3

1 上海市水產(chǎn)研究所，上海 200433
2 浙江萬里學(xué)院，浙江 寧波 315100
3 浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058

張崇文，毛芝娟，于漣. 大黃魚三種病原弧菌外膜蛋白交叉保護(hù)性抗原篩選. 生物工程學(xué)報, 2012, 28(12): 1460?1472.

Zhang CW, Mao ZJ, Yu L. Selection of cross-protective antigens from outer membrane proteins of three pathogenic vibrios isolated from infected large yellow croaker (Pseudosciaena crocea). Chin J Biotech, 2012, 28(12): 1460?1472.

弧菌是海水養(yǎng)殖環(huán)境中常見的條件性致病菌，弧菌病的暴發(fā)給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。鑒于水生動物尤其是魚類弧菌病的發(fā)生常常是多種 (血清型或亞種) 弧菌的混合感染，篩選具有潛在的交叉保護(hù)性蛋白抗原，作為制備多價疫苗或聯(lián)合疫苗的侯選成分具有重要意義。文中從患病大黃魚中分離到8株弧菌，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定分別為6株哈維氏弧菌Vibrio harveyi，1株溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和1株副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus。選擇典型的不同種的弧菌為代表，提取其外膜蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析，確定它們大約在45 kDa、35 kDa、22 kDa處出現(xiàn)了3條共同的免疫印跡條帶，表明它們很有可能含有共同的能夠彼此交叉保護(hù)的抗原。利用雙向電泳和免疫印跡相結(jié)合的方法，借助于MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌V. alginolyticus的一種功能未知的孔蛋白 (Porin, GenBank Accession No. ZP_01260407)和副溶血弧菌V. parahaemolyticus的一種麥芽糖孔蛋白的前體蛋白 (Maltoporin precursor，GenBank Accession No. NP_801154) 能夠和哈維氏弧菌V. harveyi全菌多抗產(chǎn)生免疫反應(yīng)，表明這兩種蛋白可以作為3種弧菌的交叉保護(hù)性抗原，以此制備的疫苗可望對3種弧菌的感染產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。

弧菌，鑒定，外膜蛋白，交叉保護(hù)性抗原

弧菌是海洋環(huán)境中最常見的一類條件致病菌，屬于弧菌科弧菌屬，是一類革蘭氏陰性、具極生鞭毛、能運動、無芽胞的短桿狀細(xì)菌。目前已知弧菌屬至少包括202個種[1]。近年來，隨著養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境的惡化，弧菌已成為海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一。已報道的海水養(yǎng)殖動物病原弧菌有 20多種[2]，主要有哈維氏弧菌V. harveyi、溶藻弧菌V. alginolyticus、副溶血弧菌V. parahaemolyticus、創(chuàng)傷弧菌V. vulnificus、鰻弧菌V. anguillarum和費氏弧菌V. fischeri等，其中，哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌是海洋生物尤其是海水魚類弧菌病的主要致病菌[2-5]。

與其他病原菌一樣，弧菌的致病性取決于與宿主細(xì)胞的相互作用，致病過程也包括黏附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒素等系列過程[6]。現(xiàn)已明確，外膜蛋白 (Outer membrane protein，OMP)與弧菌的黏附過程密切相關(guān)，是重要的致病因子[7]。外膜蛋白是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中所特有的結(jié)構(gòu)，是外膜的重要組成部分。國內(nèi)外對OMP免疫原性和免疫保護(hù)性進(jìn)行了大量研究，結(jié)果證實，外膜蛋白具有良好的免疫原性，可以作為保護(hù)性抗原發(fā)揮重要作用[8,9]。同時遲發(fā)性超敏反應(yīng)試驗也證明，OMP能誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)，間接證明OMP具有較強(qiáng)的引起細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力[10]。

研究還發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌的外膜蛋白中存在保守成分，同一種細(xì)菌的不同菌株的外膜蛋白圖譜很相似，僅有很小的差異，這些差異與菌株的血清型、致病性及生長條件有關(guān)[11]。目前，針對多種致病性海洋弧菌的OMP進(jìn)行了較深入的研究[10,12-16]，發(fā)現(xiàn)不同弧菌的外膜蛋白表現(xiàn)出一定的交叉免疫反應(yīng)性，可能形成某些弧菌間的共同抗原，對不同病原弧菌產(chǎn)生交叉保護(hù)[17-18]。如果能夠確定不同種 (血清型/亞種) 致病性弧菌共同保護(hù)性抗原，就可制備出針對不同種、不同血清型弧菌的通用疫苗或亞單位聯(lián)合疫苗，收到一種疫苗同時預(yù)防多種弧菌的良好效果。

本研究從患病大黃魚上分離得到幾株病原菌，經(jīng)傳統(tǒng)生理生化方法和分子生物學(xué)方法鑒定，分別為哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌，然后提取它們的外膜蛋白，經(jīng) SDS-PAGE和Western blotting分析，發(fā)現(xiàn)不同種弧菌的外膜蛋白存在著交叉反應(yīng)條帶，預(yù)示著不同種弧菌的某些外膜蛋白具有交叉保護(hù)作用。運用免疫蛋白質(zhì)組學(xué) (Immunoproteomics) 技術(shù)，采用雙向電泳和傳統(tǒng)免疫印跡相結(jié)合的方法，將具有免疫反應(yīng)性的蛋白點通過質(zhì)譜分析得到肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)，然后據(jù)此搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫，最終鑒定出這幾種病原弧菌株外膜蛋白交叉保護(hù)性抗原。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與鑒定

1.1.1 病原菌的生化鑒定

病原菌分離自患病大黃魚 (來自浙江省舟山和象山港的海水養(yǎng)殖網(wǎng)箱) 的肝臟、腎臟和脾臟中，經(jīng)腹腔注射回歸感染證實為病原菌。根據(jù)生化反應(yīng)和 API細(xì)菌鑒定系統(tǒng) (法國，梅里埃)對菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.1.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

從TCBS平板上挑選單菌落在2216E海水培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，抽提病原菌DNA。從 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中獲取相關(guān)弧菌 HSP60基因序列，利用 ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 軟件進(jìn)行序列比對，根據(jù)保守序列設(shè)計一對兼并引物。上游引物HSPFP: 5′-AACATGGGYGCRCAAATG-3′；下游引物 HSPRP: 5′-TCTTGTAGCATWGCTTTACG ACG-3′，擴(kuò)增目標(biāo)序列。目的片段 (約 600 bp) 割膠回收后直接測序并進(jìn)行序列比對。聯(lián)合從GenBank中獲取的多種相關(guān)弧菌 HSP60基因部分序列，運用 MEGA3.1軟件鄰接法構(gòu)建待定弧菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹，以確定它們的分類地位并命名。

1.2 哈維氏弧菌滅活及其抗血清制備

選取鑒定明確的哈維氏弧菌典型株接種于Zobell 2216E培養(yǎng)基28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，在菌液中加入0.5%福爾馬林，置于28 ℃滅活24 h后取樣涂TCBS平板檢查，確定無細(xì)菌生長后作為抗原，皮下多點注射免疫新西蘭大白兔，首次免疫每千克兔注射 0.5 mL細(xì)菌 (1×109cells/mL) 加0.5 mL弗氏完全佐劑，隔2周加強(qiáng)免疫1次，共2次，加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑乳化，末次加強(qiáng)免疫后2周試血，ELISA檢測血清抗體效價，滿意后頸動脈放血，離心分離血清，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Sarcosyl法抽提外膜蛋白

接種鑒定明確的副溶血弧菌和溶藻弧菌于Zobell 2216E培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。離心收獲細(xì)菌，用20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.2) 洗滌2次，沉淀重懸于含有 10 mmol/L EDTA的Tris-HCl中；超聲波破碎 (200 W) 2 次；10 000 ×g離心15 min，棄沉淀；48 000×g離心1.5 h，棄上清；沉淀溶于0.5% (W/V) Sarkosyl (上海生工生物工程有限公司) 中，48 000×g離心1.5 h，棄上清；20 mmol/L Tris-HCl 48 000×g 離心 1.5 h，重復(fù)2～3次；Bradford法定量。

1.4 凝膠電泳和免疫印跡

配置兩塊凝膠 (4%濃縮膠，12%分離膠)，其中一塊膠用考馬斯亮蘭-R250染色，另一塊用于免疫印跡。上樣前樣品沸水浴5 min，上樣量10 μg/孔，120 V恒壓電泳2.5～3 h。電泳結(jié)束后，凝膠中的外膜蛋白電轉(zhuǎn)印至NC膜上，先后加入兔抗哈維氏弧菌全菌多抗，再加入羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體 (北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，TMB Membrane Substrate顯色液 (Cell Signaling Technology，USA) 顯色。

1.5 雙向電泳

具體步驟按儀器操作說明書進(jìn)行。抽提的蛋白沉淀用1 mL裂解液溶解，8 000×g離心15 min，取適量上清 (約25 μg蛋白/膠條)，與含有DTT的重泡脹液混勻。用2根7 cm膠條 (pH：3～5.6，非線性，Amersham Pharmacia，USA)，進(jìn)行等電聚焦：重泡脹，12 h；200 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；梯度：1 000～8 000 V，0.5 h；8 000 V，5 h。聚焦結(jié)束先后放入平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ中各平衡15 min，再轉(zhuǎn)入Mini-PROTEAN Tetra電泳系統(tǒng) (Bio-Rad，USA) 進(jìn)行電泳，結(jié)束后兩塊凝膠 (分析膠和制備膠) 經(jīng)固定，敏化，漂洗后用硝酸銀溶液染色，再經(jīng)漂洗，顯色，最后將分析膠掃描后用Image Master軟件分析。

1.6 免疫印跡

采用Trans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng) (Bio-Rad，USA)，將分析膠用0.5 mA/cm2恒流轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂奶粉的封閉液中37 ℃封閉1 h，然后在兔抗哈維氏弧菌多克隆抗體 (1∶1 000) 中 37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗 (北京鼎國生物技術(shù)有限公司，1∶1 000)，37 ℃中緩慢孵育1 h。ECL反應(yīng)試劑盒顯色，膠片曝光后透射掃描。

1.7 質(zhì)譜分析

將制備膠上和免疫印跡對應(yīng)的蛋白點切下，經(jīng)無水乙腈脫水，真空干燥，加胰酶 (蛋白質(zhì)組學(xué)測序級) 消化，萃取液萃取。將酶解和萃取后的上清合并，經(jīng)真空干燥后用 0.1% TFA溶解，與等量基質(zhì)液混合，取少量混合液進(jìn)行 MALDI-TOF(Voyager DE-Pro，Applied Biosystems，USA) 質(zhì)譜分析。將生成的肽指紋圖譜用 Data Explorer TM 軟件處理后，通過 MASCOT搜索引擎(http://www.matrixscience.com/) 搜索 Swiss-Prot和NCBInr數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離和生理生化鑒定

先后從患病大黃魚中分離得到8株細(xì)菌，經(jīng)回歸感染后確定為致病菌[2-3]。在 TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，菌落呈黃色或綠色，菌落直徑約2.2～3.5 mm，菌體革蘭氏染色陰性，短桿狀，可運動，氧化酶反應(yīng)陽性，對弧菌抑制劑 O/129(150 μg/mL) 敏感，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。結(jié)合其他生化指標(biāo)結(jié)果，這些菌株屬和弧菌屬的哈維氏弧菌V. harveyi、溶藻弧菌V. alginolyticus和副溶血弧菌V. parahaemolyticus的生化特征相近，某些生化指標(biāo)和伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊 (第九版)[19]標(biāo)準(zhǔn)株的特征不一致 (表1)，尚不能最后確定為何種弧菌。這些菌株分別命名為V.sp. NB1011、V.sp. NB1012、V.sp. NB1013、V.sp. NB1014、V.sp. NB1015、V.sp. NB1016、V.sp. NB1017、V.sp. NB1018。

2.2 HSP60基因部分序列擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

PCR擴(kuò)增獲得大小約600 bp的HSP60基因特異序列。測序后比對發(fā)現(xiàn)V.sp. NB1018和V.sp. NB1014的HSP60基因部分序列完全相同，且生化特征也相同 (表 1)，據(jù)此認(rèn)定為同種弧菌。其余幾種弧菌的 HSP60 基因部分序列表現(xiàn)出一定的差異性，表明為不同的種/株 (表2)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖 1) 可以看出，7株弧菌(V.sp. NB1018和V.sp. NB1014取其一) 分別同各自同種的弧菌聚類。V.sp. NB1011同溶藻弧菌聚為一類；V.sp. NB1013和副溶血弧菌聚為一類；其余各株弧菌都同哈維氏弧菌聚類，說明它們和哈維氏弧菌親緣關(guān)系最接近，屬于哈維氏弧菌，盡管它們彼此之間也存在著進(jìn)化關(guān)系上的差異，屬于同種不同株 (亞種)。從表2中8株弧菌部分HSP60基因序列差異性比對結(jié)果也可以看出，V.sp. NB1011 (溶藻弧菌) 和V.sp. NB1013 (副溶血弧菌) 的 HSP60基因序列無論相互比對還是和其他弧菌比對，同源性都低于90.0%，因而屬于不同種；其他6株弧菌間HSP60基因的同源性皆大于95.0%，屬同種弧菌，即哈維氏弧菌，證明弧菌 HSP60基因序列種內(nèi)高度保守，種間差異明顯。

表1 API系統(tǒng)鑒定結(jié)果與相應(yīng)模式菌株結(jié)果差異Table 1 Differences of results between API system identification and the corresponding model strains

至此，8株弧菌的分類地位最終得以確定，分別命名為：V. alginolyticusNB1011，V. parahaemolyticusNB1013，V. harveyiNB1012，V. harveyiNB1014，V. harveyiNB1015，V. harveyiNB1016，V. harveyiNB1017，V. harveyiNB1018，其中V. harveyiNB1018和V. harveyiNB1014系同種同株哈維氏弧菌。7株弧菌的HSP60基因部分序列在GenBank登錄號為DQ279068-DQ279074。

2.3 哈維氏弧菌的滅活及抗血清效價檢測

將哈維氏弧菌 (V. harveyiNB1017株) 用0.5%的福爾馬林處理24 h，經(jīng)檢測充分滅活后，用無菌PBS洗滌3次，最后用PBS緩沖液懸浮，免疫新西蘭大白兔。哈維氏弧菌全菌抗血清效價根據(jù)P/N值來確定，P/N=(被檢血清的OD492?空白對照的OD492)/(陰性血清的OD492?空白對照的OD492)。當(dāng)P/N≥2.1，該點處的最高稀釋倍數(shù)即為抗血清效價。最終測得哈維氏弧菌全菌抗血清效價為1∶512 000。

2.4 凝膠電泳和免疫印跡

免疫印跡結(jié)果表明，多數(shù)哈維氏弧菌的外膜蛋白和兔抗哈維氏弧菌全菌多抗都有7～8條免疫印跡帶。溶藻弧菌和副溶血弧菌的外膜蛋白分別大約在 45 kDa、35 kDa、22 kDa (圖 2) 處出現(xiàn)了3條共同的反應(yīng)條帶，提示這3條蛋白條帶包含有3種弧菌的交叉免疫反應(yīng)條帶。

表2 8株弧菌部分HSP60基因序列差異性比對Table 2 Aligned scores of HSP60 partial sequences from 8 Vibrios by CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignments

圖1 鄰接法構(gòu)建的部分弧菌HSP60基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Neighbour-joining phylogenetic tree of partial Vibrios based on their HSP60 gene.

2.5 雙向電泳及免疫印跡結(jié)果

從雙向電泳結(jié)果 (圖3、4) 可以看出，溶藻弧菌和副溶血弧菌外膜蛋白的等電點 (pI) 都極度偏酸，大部分集中于3.0～5.0的范圍內(nèi)。分子量大約在10.0～120.0 kDa之間。除去pI小于3.0或大于5.6的蛋白點不計，大概有30～40個蛋白點被按照等電點和分子量大小分開。將分析膠上的蛋白點轉(zhuǎn)印到NC膜上后與兔抗哈維氏弧菌抗血清反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)除了分子量在 45 kDa、22 kDa處出現(xiàn)了預(yù)期的印跡條帶，分別命名為AP1，AP2(溶藻弧菌) 和PP1，PP2 (副溶血弧菌) 。和圖2中 SDS-PAGE電泳及 Western blotting結(jié)果相比，35 kDa處的印跡條帶沒有出現(xiàn)，代之以12 kDa左右的條帶，命名為AP3 (溶藻弧菌) 和PP3 (副溶血弧菌)，這一結(jié)果表明，分子量為35 kDa左右的蛋白很有可能是一個三聚體，在雙向電泳的過程中三聚體解聚，變成單體形式，即12 kDa左右的條帶。

圖2 8株弧菌外膜蛋白SDS-PAGE (A) 和Western blotting (B) 結(jié)果Fig. 2 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) for the OMPs extracted from eight Vibrios. The primary antibody (at a 1:1 000 dilution) was sera from rabbit vaccinated with the formalin killed V. harveyi NB1017; the secondary antibody(at a 1:1 000 dilution) was alkaline-phosphatase conjugated goat anti-rabbit IgG. M: molecular weight markers; 1:V. harveyi NB1017; 2: V. harveyi NB1012; 3: V. harveyi NB1018; 4: V. harveyi NB1014; 5: V. harveyi NB1015; 6:V. parahaemolyticus NB1013; 7: V. alginolyticus NB1011; 8: V. harveyi NB1016.

圖3 副溶血弧菌外膜蛋白雙向電泳圖譜 (A) 及其與兔抗哈維氏弧菌抗血清的免疫印跡 (B) 結(jié)果Fig. 3 2-DE of the OMP from V. parahaemolyticus (A) and the result of Western blotting with anti-V. harveyi serum (B).

2.6 質(zhì)譜分析結(jié)果

從制備膠上切下和免疫印跡相應(yīng)的蛋白點，經(jīng)一系列處理后上質(zhì)譜儀分析，分別獲得了溶藻弧菌和副溶血弧菌外膜蛋白AP1和PP1的肽質(zhì)量指紋圖譜。通過 MASCOT搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫，結(jié)果表明外膜蛋白 AP1是溶藻弧菌的一種孔蛋白(Porin)，其分子量為39 676 Da，等電點為4.46，GenBank的登錄號為ZP_01260407。這是一種推測的孔蛋白，功能不詳，肽質(zhì)量指紋和它的匹配率達(dá)到了35%。外膜蛋白PP1是副溶血弧菌麥芽糖孔蛋白的前體蛋白 (Maltoporin precursor)。該蛋白分子量為46 933 Da，等電點為4.63，GenBank登錄號為NP_801154，肽質(zhì)量指紋和它的匹配率達(dá)到了31%。

圖4 溶藻弧菌外膜蛋白雙向電泳圖譜 (A) 及其與兔抗哈維氏弧菌抗血清的免疫印跡 (B) 結(jié)果Fig. 4 2-DE of the OMP from V. alginolyticus (A) and the result of Western blotting with anti-V. harveyi serum (B).

3 討論

本研究從患病海水養(yǎng)殖魚類體內(nèi)分離了幾種病原細(xì)菌，經(jīng)傳統(tǒng)的API系統(tǒng)鑒定，其生化譜與模式菌株均有一定的差異，不能有效鑒定到種的水平。近年來，借助于分子生物學(xué)的方法，對微生物進(jìn)行種或種內(nèi)不同株的區(qū)分，成為一種有效的細(xì)菌鑒定方法。最初，由于16S rRNA能夠穩(wěn)定遺傳，能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，且序列長度適中 (約1.5 kb)，測序容易，被用于分子生物學(xué)分類鑒定，一度成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的國際標(biāo)準(zhǔn)方法[20]。但Stackebrandt等[21]認(rèn)為16S rRNA序列同源性分析比較適合于屬以上的分類介元親緣關(guān)系的研究，而對于屬以下的分類單位，其分辨率明顯不足。近幾年來的研究表明，HSP60 (Heat shock protein) 基因具有高度保守的一級結(jié)構(gòu)，比16S rRNA基因攜帶更多的多態(tài)信息，是系統(tǒng)進(jìn)化分析的有效分子標(biāo)記，在近緣細(xì)菌間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析中顯示優(yōu)于 16S rRNA 基因序列[22]。因此，我們采用 HSP60基因部分序列比對的方法對分離到的海水魚類致病性弧菌進(jìn)行了更細(xì)致的分類，明確鑒定出8株弧菌分別屬于溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌3種，其中哈維氏弧菌包括5個不同菌株?；【?HSP60序列分析表明，不同弧菌種類 HSP60基因的同源性低于 90.0%，同種弧菌間 HSP60基因的同源性大于 95.0%，與 Kwok等[23]利用HSP60基因部分序列研究葡萄球菌屬系統(tǒng)發(fā)育時，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)序列的相似性為91%～98%，種間的序列相似性為74%～93% (平均為82%) 的結(jié)果基本相符。

外膜蛋白是革蘭氏陰性細(xì)菌的特有成分，位于細(xì)胞的最外層。近年來，關(guān)于外膜蛋白免疫原性的研究取得了很大進(jìn)展，同時發(fā)現(xiàn)不同種弧菌之間其外膜蛋白存在交叉保護(hù)。為了研究這3種8株弧菌的外膜蛋白的免疫反應(yīng)性，首先制備了兔抗哈維氏弧菌全菌多抗，通過 SDS-PAGE和Western blotting分析，發(fā)現(xiàn)這8株弧菌的外膜蛋白出現(xiàn)了3～7條免疫反應(yīng)條帶，其中有3個條帶為3種弧菌所共有，分別在22 kDa、35 kDa和45 kDa處，意味著這3條蛋白中有可能包含哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌3種弧菌的交叉保護(hù)性抗原。接著選擇鑒定明確的溶藻弧菌、副溶血弧菌為典型株，采用雙向電泳及免疫印跡相結(jié)合的方法，對它們的外膜蛋白的分子組成進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，兩種弧菌的外膜蛋白包含分子量在10～120 kDa，等電點在3.0～5.0之間的蛋白約30～50個，其中分子量在12 kDa、22 kDa和45 kDa處的3條蛋白帶能夠跟異源抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，表明這3條帶中含有能夠和哈維氏弧菌發(fā)生交叉免疫反應(yīng)的外膜蛋白。對比雙向電泳免疫印跡結(jié)果和SDS-PAGE、Western blotting結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE中35 kDa處的印跡條帶在雙向電泳后并沒有印跡點出現(xiàn)，而在12 kDa處卻出現(xiàn)了明顯的印跡點。這分明是由于，35 kDa處的蛋白可能是三聚體，在雙向電泳的過程中解聚成為12 kDa左右的單體分子，該蛋白也具有交叉免疫反應(yīng)性。已有相關(guān)研究顯示，外膜蛋白在外膜上可以是三聚體也可以是單體分子[24-27]。哈維氏弧菌、溶藻弧菌的外膜蛋白OmpK，E. coli的OmpA是以單體形式形成孔道，而E. coli的OmpF，溶藻弧菌的OmpW是以3個單體構(gòu)成一個具有特定功能的三聚體，通過許許多多暴露在外表面的環(huán)之間的相互作用而緊密地聯(lián)系在一起，這種緊密的構(gòu)型穿插在外膜當(dāng)中，形成一個緊湊的分子結(jié)構(gòu)，而將那些特異的且高度變異的結(jié)構(gòu)域暴露于細(xì)胞表面，它們與外膜的各種生物活性有關(guān)。

外膜蛋白因其含有豐富的疏水性氨基酸，在一般溶液中很難完全溶解，這對外膜蛋白的雙向電泳極為不利，因為樣品能夠被裂解液充分裂解是雙向電泳成功的關(guān)鍵。為了解決這一難題，對裂解液的成分進(jìn)行了改進(jìn)，增加了硫脲等增進(jìn)樣品溶解的成分，并用兩性離子去污劑CHAPS作為表面活性劑，在一定程度上改善了外膜蛋白溶解性，有利于等電聚焦的順利進(jìn)行。根據(jù)免疫印跡結(jié)果，從雙向電泳制備膠上切取相對應(yīng)的蛋白點 AP1、AP2、AP3 (溶藻弧菌) 和 PP1、PP2、PP3 (副溶血弧菌)，經(jīng)萃取、胰酶膠內(nèi)酶解等一系列處理后，進(jìn)行質(zhì)譜分析。副溶血弧菌(V. parahaemolyticusRIMD 2210633，GenBank Accession No. BA000032) 和溶藻弧菌(V. alginolyticus12G01，GenBank Accession No.NZ_AAPS01000012) 的全基因組序列已經(jīng)測序完成[28]，因此來自副溶血弧菌V. parahaemolyticusNB1013外膜蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜搜索結(jié)果應(yīng)該和副溶血弧菌 (V. parahaemolyticusRIMD 2210633，GenBank Accession No. BA000032) 關(guān)聯(lián)度最高；來自溶藻弧菌 (V. alginolyticusNB1011) 外膜蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜搜索結(jié)果應(yīng)該和溶藻弧菌 (V. alginolyticus12G01，GenBank Accession No. NZ_AAPS01000012) 最為匹配。我們將分別和溶藻弧菌AP1、副溶血弧菌 PP1唯一對應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜通過MASCOT搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫，結(jié)果表明外膜蛋白AP1和溶藻弧菌V. alginolyticus12G01的一種孔蛋白 (Porin) 十分匹配 (35%)，其分子量為49 676 Da，等電點為4.46，GenBank的登錄號為ZP_01260407。這是一種推測的孔蛋白，功能尚不清楚。外膜蛋白 PP1和數(shù)據(jù)庫中副溶血弧菌V. parahaemolyticusRIMD 2210633的麥芽糖孔蛋白的前體蛋白 (Maltoporin precursor) 高度匹配 (31%)。該蛋白分子量為46 933 Da，等電點為4.63，GenBank登錄號為NP_801154。麥芽糖孔蛋白是一個和麥芽糖-糊精的輸送有關(guān)的孔蛋白，可以在外膜上形成通道并結(jié)合成三聚體結(jié)構(gòu)，有利于麥芽糖-糊精及其他糖類順利通過革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜。它和溶藻弧菌的推測孔蛋白同為弧菌的抗原蛋白，而且在不同弧菌之間具有交叉免疫反應(yīng)性，可以作為弧菌的交叉保護(hù)性抗原候選成分。按照同樣的方法可以鑒定出溶藻弧菌AP2和AP3，副溶血弧菌PP2和PP3，遺憾的是由于我們所用的質(zhì)譜儀發(fā)生了故障影響了后續(xù)工作按計劃進(jìn)行。

我們的研究結(jié)果提示，采用異源血清來篩選弧菌外膜蛋白中具有交叉免疫反應(yīng)性的抗原蛋白，作為開發(fā)多價疫苗的候選成分的方法是可行的。有人把僅針對微生物的某類特別成分的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)稱為局部免疫蛋白質(zhì)組學(xué)(Sub-immunoproteomics)[29]，這種局部成分的雙向電泳可以看作是整體雙向電泳的有效補(bǔ)充。這種方法具有特異性好、快速、高通量的特點，在微生物的抗原蛋白篩選方面必將發(fā)揮更大的作用。當(dāng)然，需要指出的是，這里篩選到的只是潛在可能的交叉保護(hù)性抗原，這些蛋白抗原在實際免疫預(yù)防中的保護(hù)率究竟怎樣，需要通過以此構(gòu)制多價疫苗 (抗原)，免疫大黃魚，再進(jìn)行感染實驗，方能最后確定其是否具有交叉保護(hù)的能力，甚至需要考慮如何通過輔以佐劑的方法增強(qiáng)其免疫原性，使其達(dá)到實際生產(chǎn)中真正有效可行的疫苗水平。致謝：本研究得到了浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院余應(yīng)年教授實驗室的大力支持，特此致謝。

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July 11, 2012; Accepted: November 7, 2012

Lian Yu. Tel/Fax: +86-571-88982242; E-mail: yulian@zju.edu.cn

浙江省科技計劃重點科研社會發(fā)展項目 (No. 2005C23085) 資助。

Selection of cross-protective antigens from outer membrane proteins of three pathogenic vibrios isolated from infected large yellow croaker (Pseudosciaena crocea)

Chongwen Zhang, Zhijuan Mao, and Lian Yu

1Shanghai Fisheries Research Institute,Shanghai200433,China
2Zhejiang Wanli University,Ningbo315100,Zhejiang,China
3College of Animal Science,Zhejiang University,Hangzhou310058,Zhejiang,China

Vibrios are universal conditioned-pathogenic bacteria in marine culture environment, and the outbreak of vibrio disease resulted in a serious damage to aquaculture. Considering that vibrio disease in aquatic species, especially fishes, usually originated from mixed infection of different species (serotypes or subspecies) of vibrios, it is important to select the potential cross-protective protein antigens as candidates of polyvalent or combined vaccines. In present research,several strains of vibrios were isolated from infected large yellow croaker (Pseudosciaena crocea) and subsequently identified as six strains ofV. harveyi, oneV. parahaemolyticusand oneV. alginolyticusby physiological, biochemical and molecular biological methods. Their outer membrane proteins (OMPs) were extracted and the SDS-PAGE and Western blotting results show that three immuno-blots with common molecular weight presented at approximate 45 kDa, 35 kDa and 22 kDa on their OMP electrophoretogram, indicating the existence of antigens with cross-protection in their OMPs. With the aids of combination of two-dimensional electrophoresis (2-D) and Western blotting and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), a deduced porin (GenBank Accession No.ZP_01260407) fromV. alginolyticusand a maltoporin precursor (GenBank Accession No. NP_801154) fromV.parahaemolyticuswere able to react with polyclonal antibody to wholeV. harveyi,suggesting these two proteins could act as the cross-protective antigens and the vaccines prepared with these porins would be probable to bring cross protection to three different vibrios.

Vibrios, identification, outer membrane protein, cross-protective protein antigens

Supported by: Key Science Research and Society Development Programs of Zhejiang Province, China (No. 2005C23085).