λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)的改造及其對大腸桿菌菌蛻制備的影響

董洪亮，韓先干，白灝，何亮，劉蕾，劉瑞，柴同杰，丁鏟，劉海文，于圣青

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安 2710002 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)的改造及其對大腸桿菌菌蛻制備的影響

董洪亮1,2，韓先干2，白灝2，何亮2，劉蕾2，劉瑞2，柴同杰1，丁鏟2，劉海文2，于圣青2

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安 271000
2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

董洪亮, 韓先干, 白灝, 等. λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)的改造及其對大腸桿菌菌蛻制備的影響. 生物工程學(xué)報, 2012,28(12): 1423?1430.

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菌蛻是革蘭氏陰性菌在噬菌體Phix174的溶菌基因E的作用下形成的細(xì)菌空殼，通常由λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)通過調(diào)控E基因的表達(dá)制備。通過重疊PCR技術(shù)，將λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)中λpR啟動子的第2個操縱基因 (OR2) 的第9位堿基由T突變?yōu)镃 (T→C)。溶菌試驗結(jié)果表明，突變后的λpL/pR-cI857系統(tǒng)在37 ℃時仍能穩(wěn)定抑制基因E的表達(dá)，對大腸桿菌的溶菌率為99.9%。通過對λpR啟動子的改造，擴(kuò)大了λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)的溫度調(diào)控范圍，為菌蛻疫苗的研制提供了參考。

大腸桿菌，菌蛻，重疊PCR，突變

菌蛻 (Bacterial ghost) 是通過PhiX174噬菌體溶菌基因E的可調(diào)控表達(dá)而形成的缺少細(xì)胞漿和核酸且無繁殖能力的革蘭氏陰性細(xì)菌空殼[1]。溶菌基因E編碼91個氨基酸的疏水蛋白，它能在革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜上形成一個直徑約為40～200 nm的特異性的跨膜孔道，在滲透壓的作用下使革蘭氏陰性細(xì)菌的胞質(zhì)內(nèi)含物由孔道排出，從而形成不含核酸、核糖體及其他組分的細(xì)菌空殼[2-6]。菌蛻作為一種新型的疫苗，與傳統(tǒng)的滅活疫苗相比，菌蛻保持了細(xì)菌原有的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)菌表面抗原結(jié)構(gòu)和黏附性等特性，因而能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫、細(xì)胞免疫以及黏膜免疫[7-10]。

通常用 λpL/pR-cI857溫控制系統(tǒng)控制溶菌基因E的表達(dá)來制備菌蛻。這一溫控系統(tǒng)在高于30 ℃時，阻遏蛋白cI857因熱失活，并引起E基因的表達(dá)，在42 ℃時達(dá)到最佳的細(xì)菌溶菌效果[11]。但在菌蛻制備過程中存在兩點(diǎn)不足，一是溶菌前細(xì)菌需要在30 ℃以下進(jìn)行培養(yǎng)，不利于細(xì)菌的大量生產(chǎn)。二是溫度由 30 ℃突然轉(zhuǎn)為42 ℃時，熱沖擊容易對抗原決定簇結(jié)構(gòu)造成影響。本實驗通過定點(diǎn)突變技術(shù)，使λpR啟動子的第2個操縱基因 (OR2) 的第9位堿基由T突變?yōu)镃 (T→C)，突變后的λpL/pR-cI857系統(tǒng)在37 ℃時仍能穩(wěn)定抑制基因 E的表達(dá)，而當(dāng)溫度達(dá)到39 ℃～42 ℃時開始誘導(dǎo)溶菌。本研究通過對λpL/pR-cI857系統(tǒng)的優(yōu)化，成功解決菌蛻制備過程中存在的不足，為進(jìn)一步研究菌蛻疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑

pUC19-cI857-E-rrnB溶菌質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建保存[12]。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生物技術(shù)有限公司，鴨源禽致病性大腸桿菌DE17株由本實驗室分離保存[13]。

限制性內(nèi)切酶SphⅠ和PstⅠ購自寶生物技術(shù)有限公司。普通質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司。GenJETTMPCR Extraction Kit購自 Fermentas。2×TaqPCR Master Mix，DNA Ligation Kit，DNA marker 5000以及pUC19載體購自TaKaRa公司。

1.2 溶菌表達(dá)盒cI857-E-rrnB的擴(kuò)增

用引物cI857-F/rrnB-R (表1) 擴(kuò)增溶菌質(zhì)粒pUC19-cI857-E-rrnB中長度為1 589 bp的溶菌表達(dá)盒cI857-E-rrnB。

1.3 溶菌表達(dá)盒的點(diǎn)突變

cI857-E-rrnB溶菌表達(dá)盒中的λpR啟動子有3個操縱基因 (ORs)，其中第 2個操縱基因(OR2) 序列為 5′-TAACACCGTGCGTGTTG-3′[14]。對其第9位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變 (圖1)。

以本實驗室構(gòu)建的 pUC19-cI857-E-rrnB為模板，以cI857-F/cI857-mutR為引物擴(kuò)增大小為783 bp的ΔcI857-E片段，以cI857-mutF/rrnB-R為引物擴(kuò)增大小為806 bp的ΔcI857-rrnB片段。PCR產(chǎn)物用GenJETTMPCR Extraction Kit試劑盒回收。以回收的 ΔcI857-E (模板 1) 片段和ΔcI857-rrnB (模板2) 片段同時作為模板，用引物cI857-F/rrnB-R擴(kuò)增大小為 1 589 bp的 ΔcI857-E-rrnB片段。PCR的反應(yīng)條件為：95 5℃ min；98 10℃ s，55 5℃ s，72 2℃ min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.4 溶菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶SphⅠ和PstⅠ對純化的ΔcI857-E-rrnB片段和pUC19載體進(jìn)行酶切、連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用含100 μg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。將PCR鑒定為陽性的克隆，轉(zhuǎn)接到含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測序鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pUC19-ΔcI857-E-rrnB。

表1 本研究中PCR擴(kuò)增所用引物序列Table 1 Primer sequence for PCR amplification in this study

圖1 點(diǎn)突變示意圖Fig. 1 Operator/promoter sequence of the mutated rightward λpR promoter.

1.5 溶菌實驗

將質(zhì)粒 pUC19-cI857-E-rrnB、pUC19-ΔcI857-E-rrnB以及pUC19分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，并將質(zhì)粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB轉(zhuǎn)化本實驗室分離的禽致病性大腸桿菌DE17中，挑取上述轉(zhuǎn)化中的陽性克隆，分別在 28 ℃和 37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.4后，轉(zhuǎn)至42 ℃培養(yǎng)，每隔20 min取100 μL菌液測其OD600，繪制溶菌曲線。

分別取上述42 ℃誘導(dǎo)0 h和4 h后的菌液100 μL，10倍稀釋后，接種到含 100 μg/mL Amp的 LB固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)過夜后進(jìn)行活菌計數(shù)，每個稀釋度3個重復(fù)。計算細(xì)菌溶菌效率，計算公式為：溶菌率=(1?誘導(dǎo)后 CFU/誘導(dǎo)前CFU) ×100%。

2 結(jié)果

2.1 溶菌質(zhì)粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB的構(gòu)建

以cI857-F/cI857-mutR為引物，成功擴(kuò)增大小為 783 bp的 ΔcI857-E片段 (圖 2，泳道 1)，以 cI857-mutF/rrnB-R為引物，成功擴(kuò)增大小為806 bp 的 ΔcI857-rrnB (圖 2，泳道 3)，以cI857-F/rrnB-R為引物，運(yùn)用重疊PCR技術(shù)，成功擴(kuò)增大小為 1 589 bp的溶菌表達(dá)盒ΔcI857-E-rrnB片段 (圖2，泳道5)。

對構(gòu)建的溶菌質(zhì)粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果在預(yù)期位置 (1 589 bp處)出現(xiàn)目的條帶，表明溶菌表達(dá)盒 ΔcI857-E-rrnB成功克隆至pUC19 (圖3)。

對pUC19-ΔcI857-E-rrnB的測序結(jié)果表明，λpR啟動子中操縱基因的OR2 的第9位堿基成功地由T誘變?yōu)镃 (T→C) (圖4)。

圖2 PCR擴(kuò)增ΔcI857-E-rrnBFig. 2 PCR amplification of ΔcI857-E-rrnB. M: DNA marker DL-2000; 1: PCR product of ΔcI857-E; 3: PCR product of ΔcI857-rrnB; 5: PCR product of ΔcI857-E-rrnB; 2,4,6: negative control.

圖3 pUC19-ΔcI857-E-rrnB雙酶切鑒定Fig. 3 Degestion analysis of plasmid pUC19-ΔcI857-E-rrnB. M: DNA marker DL-5000; 1: pUC19-ΔcI857-E-rrnB digested with Sph I and Pst I; 2: PCR product of ΔcI857-E-rrnB.

2.2 大腸桿菌溶菌動力學(xué)比較

轉(zhuǎn)化溶菌質(zhì)粒pUC19-cI857-E-rrnB和pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α在28 ℃培養(yǎng)至OD600值約為0.4后，轉(zhuǎn)入42 ℃培養(yǎng)80 min后DH5α的OD600值均達(dá)到約0.9，隨后開始下降，培養(yǎng)200 min后，OD600值降至約0.2后保持不變。而含有pUC19的大腸桿菌DH5α的OD600值一直增加約1.3后，維持不變 (圖5)。

轉(zhuǎn)化溶菌質(zhì)粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α和禽致病性大腸桿菌DE17，在37 ℃培養(yǎng)至OD600值約為0.4后，轉(zhuǎn)入42 ℃培養(yǎng)，其OD600值均持續(xù)增大，60 min后，OD600達(dá)到約1.0，隨后開始下降，培養(yǎng)200 min后，OD600值降至約 0.7后保持不變。而轉(zhuǎn)化溶菌質(zhì)粒pUC19-cI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，在37 ℃培養(yǎng)直至OD600值約為0.4后，轉(zhuǎn)入42 ℃培養(yǎng)，OD600值在60 min后達(dá)到約0.6，隨后一直維持穩(wěn)定 (圖6)。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pUC19的大腸桿菌DH5α，其OD600值在從37 ℃轉(zhuǎn)為42 ℃后，一直上升直至達(dá)到平臺期 (OD600=1.3)。

圖4 點(diǎn)突變測序圖譜Fig. 4 Mutated identification by DNA sequencing.

圖5 大腸桿菌溶菌動力學(xué)曲線 (28 ℃培養(yǎng))Fig. 5 Growth and lysis curves of bacteria (28 ℃).

2.3 不同誘導(dǎo)溫度對溶菌率的影響

轉(zhuǎn)化溶菌質(zhì)粒pUC19-cI857-E-rrnB和pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，在28 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.4，轉(zhuǎn)入42 ℃誘導(dǎo)4 h后，溶菌率都可達(dá)到99.95%。

轉(zhuǎn)化溶菌質(zhì)粒pUC19-cI857-E-rrnB和pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，在37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.4，轉(zhuǎn)入42 ℃誘導(dǎo)4 h后，溶菌率分別為61.53%和99.94%。

轉(zhuǎn)化溶菌質(zhì)粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB的禽致病性大腸桿菌DE17，在37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.4，轉(zhuǎn)入42 ℃誘導(dǎo)4 h后，溶菌率為99.93% (表2)。

圖6 大腸桿菌溶菌動力學(xué)曲線 (37 ℃培養(yǎng))Fig. 6 Growth and lysis curves of bacteria (37 ℃).

表2 不同溫度對溶菌質(zhì)粒溶菌效率的比較Table 2 Comparison of the efficiency of bacterial lysates

3 討論

與常規(guī)疫苗相比，菌蛻具有與活菌相同功能的膜抗原結(jié)構(gòu)，可誘導(dǎo)機(jī)體同時產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。此外，菌蛻成本低廉，易于大規(guī)模生產(chǎn)，且制成的凍干苗在室溫下即可長時間保存，免疫時也無需加入佐劑，因其本身就具有佐劑的性質(zhì)。包括大腸桿菌在內(nèi)，目前許多革蘭氏陰性菌均能在溶菌基因 E的作用下產(chǎn)生菌蛻[15-17]。如：多殺性巴氏桿菌菌蛻，霍亂弧菌菌蛻，沙門氏菌菌蛻等，用多殺性巴氏桿菌菌蛻免疫家兔，可以抵抗同源細(xì)菌的感染[18-19]；用霍亂弧菌菌蛻腹腔注射免疫小鼠，可產(chǎn)生霍亂弧菌特異性IgG反應(yīng)和高效價抗體[20-21]；用沙門氏菌菌蛻和傳統(tǒng)的滅活菌免疫家禽，攻毒后發(fā)現(xiàn)菌蛻組表現(xiàn)出完全的免疫力，而滅活組仍攜帶有致病菌[22-23]。正是由于菌蛻具有如此多的優(yōu)點(diǎn)，使得菌蛻日益成為當(dāng)前疫苗研究的熱點(diǎn)。

目前，通常運(yùn)用 λpL/pR-cI857轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，來實現(xiàn)Phix174的溶菌基因E可控表達(dá)的。但在菌蛻制備過程中存在兩點(diǎn)不足，一是溶菌前細(xì)菌需要在30 ℃以下進(jìn)行培養(yǎng)，不利于細(xì)菌的大量生產(chǎn)。二是溫度由30 ℃突然轉(zhuǎn)為42 ℃時，熱沖擊容易對抗原決定簇結(jié)構(gòu)造成影響。因此，開展對pL/pR-cI857轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)的優(yōu)化，實現(xiàn)λpL/pR-cI857系統(tǒng)在37 ℃時仍能穩(wěn)定抑制基因E的表達(dá)，解決菌蛻制備過程中存在的不足，為進(jìn)一步開展菌蛻疫苗的研制提供技術(shù)支持，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義[24]。

本實驗通過定點(diǎn)突變技術(shù)，使λpR啟動子的第2個操縱基因 (OR2) 的第9位堿基由T突變?yōu)镃 (T→C)，突變后的λpR系統(tǒng)在37 ℃的高溫下仍能穩(wěn)定抑制基因 E的表達(dá)，而當(dāng)溫度達(dá)到39 ℃～42 ℃時開始誘導(dǎo)細(xì)胞溶菌。溶菌試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化溶菌質(zhì)粒pUC19-cI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，在37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.4，轉(zhuǎn)入42 ℃誘導(dǎo)4 h后，溶菌率為61.53%，明顯低于其他實驗組的溶菌效率。這主要是因為轉(zhuǎn)化溶菌質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α在37 ℃培養(yǎng)時，由于溫度已經(jīng)高于30 ℃，阻遏蛋白cI857失活，E基因已經(jīng)開始表達(dá)，導(dǎo)致大部分細(xì)菌在37 ℃已經(jīng)溶菌死亡。而轉(zhuǎn)化pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，則可以在37℃的條件下穩(wěn)定生長，42 ℃誘導(dǎo)后，可以引起細(xì)菌的溶菌，生成菌蛻。上述結(jié)果表明，通過對λpR啟動子的突變，成功實現(xiàn)了λpL/pR-cI857系統(tǒng)在37 ℃時溶菌基因E的抑制作用。

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichia coli，APEC) 引起的嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的傳染病之一[25]。目前，國內(nèi)對禽大腸桿菌病的防治除加強(qiáng)管理外，主要采用藥物防治，國內(nèi)尚缺乏自主研制的商品化疫苗。本研究中，APEC的 DE17分離株轉(zhuǎn)化pUC19-ΔcI857-E-rrnB后，在37 ℃的培養(yǎng)條件下，E基因的表達(dá)被成功抑制，42 ℃誘導(dǎo)后，生成APEC的菌蛻，為進(jìn)一步研究APEC的菌蛻疫苗用于該病的防治提供思路。

本研究通過對λpL/pR-cI857系統(tǒng)的優(yōu)化，使得λpL/pR-cI857系統(tǒng)在37 ℃時仍能穩(wěn)定抑制基因 E的表達(dá)，解決了菌蛻制備過程中存在的不足，為進(jìn)一步研究菌蛻疫苗提供參考。

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August 4, 2012; Accepted: September 28, 2012

Shengqing Yu. Tel: +86-21-34293461; E-mail: yus@shvri.ac.cn Xian’gan Han. Tel: +86-21-34293412; E-mail: hanxgan@163.com

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31001078，31072161，30871851) 資助。

Mutation of λpL/pR-cI857 system for production of bacterial ghost inEscherichia coli

Hongliang Dong1,2, Xian’gan Han2, Hao Bai2, Liang He2, Lei Liu2, Rui Liu2, Tongjie Chai1,Chan Ding2, Haiwen Liu2, and Shengqing Yu2

1School of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Taian271100,Shandong,China
2Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai200241,China

Bacterial ghost is intact envelope of Gram-negative bacteria, which is produced by the function of the lysis gene E from bacteriophage PhiX174. The expression of the lysis gene E is usually controlled by the thermosensitive λpL/pR-cI857 promoter. In this study, we described a mutation (T→C) at the ninth nucleotide of the OR2 in the λpR promoter of the λpL/pR-cI857 system by overlap PCR. The bacteriolytic assay showed that the mutation in the λpL/pR-cI857 system enhanced the temperature of repressing the expression of gene E up to 37 ℃ . The lysis efficiency of altered λpR promoter inEscherichia coliDH5α and avian pathogenicE. coliDE17 was up to 99.9%. The expanded range of temperature will benefit for the production of bacterial ghost.

Escherichia coli, bacterial ghosts, overlap PCR, mutation

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31001078, 31072161, 30871851).