去氫甲睪酮ELISA 試劑盒的研制

姚 萍，董 英，王 云，張 勛

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

去氫甲睪酮（1－dehydro－17a－methyltestosterone，DMT）是一種人工合成的蛋白同化類激素，又名大力補(bǔ)、美雄酮，化學(xué)名為17β－羥基－17α－甲基雄甾－1，4－二烯－3－酮。在臨床上DMT可用于再生障礙性貧血、男性發(fā)育遲緩、燒傷處理等疾病的治療[1－2]。DMT還具有促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)沉積和改善生產(chǎn)性能的作用，在畜牧業(yè)上被用作動(dòng)物飼料添加劑，以促進(jìn)動(dòng)物生長，提高產(chǎn)量[3－4]。但蛋白同化激素作為飼料添加劑應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)時(shí)，會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留。當(dāng)人們長期食用含有該藥物殘留的動(dòng)物性食品時(shí)，會(huì)嚴(yán)重危害人類健康，如導(dǎo)致肝功能障礙，生殖功能紊亂，增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)等[5]。因此，研制靈敏、高效、穩(wěn)定的DMT殘留檢測方法非常重要。目前，激素的檢測方法主要有GC－LC和LCMS[6]，具有定量檢測、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，但是其檢測成本高、樣品預(yù)處理繁瑣、費(fèi)時(shí)耗力，不適于大量樣品的篩檢。免疫學(xué)檢測方法具有靈敏準(zhǔn)確，快速簡便等特點(diǎn)，特別適合于小分子藥物的現(xiàn)場快速檢測[7－9]，近年來得到了較為廣泛的應(yīng)用。

本研究以江蘇大學(xué)食品營養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的一株能穩(wěn)定分泌去氫甲睪酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ)[10]，應(yīng)用 ELISA 原理[11]研制去氫甲睪酮?dú)埩艨焖贆z測試劑盒，并且對其各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了測定，為開發(fā)利用該試劑盒提供試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和雜交瘤細(xì)胞株 Balb／c小鼠由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；DMT－BSA完全抗原、穩(wěn)定分泌去氫甲睪酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1D6F10B4，江蘇大學(xué)食品營養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 主要試劑 去氫甲睪酮、丙酸睪酮酯、群勃龍，Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（HRP－IgG），Genescript公司；Tween 20，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透析袋（截留分子質(zhì)量14ku），上海華美生物工程公司；試驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。

0.06 mol／L、pH 4.8的醋酸緩沖液，包被緩沖液CBS（0.05mol／L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液），稀釋液PBS（0.01mol／L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液），封閉液（含20g／L甘氨酸的PBS），洗滌緩沖液PBST（含5mL／L Tween－20的 PBS），終止液（2 mol／L的硫酸溶液），酶底物（四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸緩沖溶液），均自行配制。

1.1.3 儀器設(shè)備 多功能酶標(biāo)檢測儀synergy HT，美國 Bio－TEK instruments；萬分之一電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PH050A型培養(yǎng)箱／干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；96孔可拆卸酶標(biāo)板，Corning公司；移液器，德國Eppendorf；WH－2微型漩渦振蕩儀，上海滬西儀器分析廠。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體的制備與純化 將凍存的可以穩(wěn)定分泌去氫甲睪酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1D6F10B4復(fù)蘇，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取6周齡左右的健康Balb／c小鼠腹腔注射滅菌石蠟，10d后腹腔注射處于對數(shù)生長期的去氫甲睪酮雜交瘤細(xì)胞，每只1.0×106個(gè)。間隔1周后采集腹水，經(jīng)12000 r／min離心15min預(yù)處理，棄沉淀，收集上清液。

將采集的小鼠腹水用辛酸－硫酸銨法純化獲得單克隆抗體，具體步驟如下：①取適量經(jīng)預(yù)處理的小鼠腹水，用0.06mol／L、pH 4.8的醋酸緩沖液稀釋2倍；②按33μL／mL原始腹水的比例，30min內(nèi)逐滴加入正辛酸，邊滴邊攪拌；于4℃靜置2h后，12000r／min離心20min，取上清液經(jīng)過濾紙過濾；②加入1／10上清液體積的0.1mol／L、pH 7.4的PBS，并用1mol／L NaOH 調(diào)pH 至7.4；④上清液在4℃冰浴條件下，按277g／L的比例加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，30min內(nèi)加完，4℃靜置2h以上；⑤在4℃ 以12000r／min離心30min，棄上清液，收集沉淀，將沉淀溶于一定體積的PBS，并于4℃下置于50倍～100倍的PBS中透析除鹽2d～3 d，期間每天更換3次透析液。分裝之后凍存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單抗效價(jià)的測定 間接ELISA法測定單抗效價(jià)。將單抗分別稀釋4000、8000、16000、32000、64000、128000倍，設(shè)置平行，并加稀釋5000倍的陰性血清作為對照。酶標(biāo)儀測定450nm的吸光度值OD 450nm。陽性血清的OD 450nm≥陰性對照OD 450nm的2.1倍，此時(shí)的單抗的最高稀釋倍數(shù)即為效價(jià)。

1.2.3 DMT包被抗原與單抗工作濃度的確定 方陣滴定法確定DMT包被抗原與單抗的最佳工作濃度。

1.2.4 試劑盒競爭ELISA檢測方法的建立DMT間接競爭ELISA的具體操作步驟如下：①包板：每孔加入1μg／mL的完全抗原DMT－BSA 100μL進(jìn)行包被，置于4℃過夜，PBST洗板3次，在吸水紙上拍干；②封閉：每孔加入封閉液200μL，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2h，PBST洗板3次，在吸水紙上拍干；③加一抗：每孔加入DMT標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的待測樣品（40μL／孔），各做3個(gè)重復(fù)，然后加入稀釋8000倍的DMT抗體（60μL／孔），置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)溫育50min，PBST洗板3次，在吸水紙上拍干；④加二抗：每孔加入100μL稀釋5000倍的HRP酶標(biāo)山羊抗鼠IgG，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)溫育1h，PBST洗板4次、在吸水紙上拍干；⑤顯色：每孔加入100μL TMB顯色液，37℃溫育10min；⑥終止：每孔加入終止液2mol／L H2SO450μL。酶標(biāo)儀測定吸光度OD 450nm值。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與曲線擬合 用競爭ELISA 法測定單抗對不同濃度（0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100ng／mL）DMT標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率，以吸光率百分比B／B0（B是不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的OD 450 nm值，B0是零濃度標(biāo)準(zhǔn)液的OD 450nm值）為y軸，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)值lg（DMT）為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推導(dǎo)出回歸方程，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.6 試劑盒準(zhǔn)確度的檢測 以加標(biāo)豬肉糜為樣品，對試劑盒進(jìn)行檢測回收率試驗(yàn)：豬肉糜陽性樣品的制備[12]：取5g（精確至0.01g）豬肉糜置于50mL離心管中，加入5mL純水，再加入不同濃度的DMT標(biāo)準(zhǔn)品；加入叔丁基甲醚20mL，渦旋混勻器混勻1min，超聲波發(fā)生器中超聲波提取10min，之后8000r／min離心5min，上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一支50mL離心管中；下層再用20mL叔丁基甲醚分2次提取，合并有機(jī)相；將有機(jī)相40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加20mL／L甲醇－PBS定容至10mL，使DMT的終濃度分別為0.1、1、5、10、50、100ng／mL；進(jìn)行ELISA測定，計(jì)算檢測回收率。

1.2.7 試劑盒精密度的檢測 一般用變異系數(shù)來表示，包括標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)試驗(yàn)和樣品可重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)試驗(yàn) 取3塊不同酶標(biāo)板，每板隨機(jī)抽取4個(gè)孔，均測定1ng／mL DMT標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD 450nm值，計(jì)算變異系數(shù)（CV）。

1.2.7.2 樣品可重復(fù)試驗(yàn) 取3塊不同酶標(biāo)板，每板隨機(jī)抽取4個(gè)孔，測定DMT終濃度為5ng／mL的豬肉糜的回收率，計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.8 試劑盒特異性的檢測 選擇DMT的結(jié)構(gòu)類似物丙酸睪酮酯、群勃龍作抑制物，濃度均設(shè)定為系列濃度 0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 ng／mL，競爭ELISA測定其IC50，計(jì)算與DMT的交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率＝（DMT的IC50／競爭物的IC50）×100%。

1.2.9 試劑盒穩(wěn)定性的檢測 對在4℃下保存0、30、90、180d的試劑盒做競爭ELISA試驗(yàn)，檢測系列濃度0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100ng／mL DMT標(biāo)準(zhǔn)品的ODmax值、IC50值。

2 結(jié)果

2.1 單抗的效價(jià)

將抗體分別稀釋4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000倍，陰性血清稀釋5000倍，ELISA測定其OD 450nm值，結(jié)果如表1所示。以抗體的OD 450nm值大于等于陰性血清對照的OD 450nm值的2.1倍作為抗血清的效價(jià)，對照表1所示，其抗體效價(jià)為64000，達(dá)到制備酶聯(lián)免疫試劑盒的要求。

2.2 DMT包被抗原和單抗的工作濃度

棋盤法結(jié)果如表2所示，吸光值最接近1.0所對應(yīng)的DMT包被抗原的工作濃度1μg／mL，單抗的稀釋倍數(shù)為1∶8000，即為包被抗原和抗體的最佳工作濃度。

表1 抗體效價(jià)的測定Table1 Determination of antibody titer

表2 棋盤法結(jié)果Table2 The result of checkerboard method

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性回歸方程為y＝－0.2055x＋0.516，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9931，線性范圍為0.1ng／mL～100ng／mL。根據(jù)回歸方程計(jì)算出IC50值為3.20ng／mL。最低檢測限LOD（相當(dāng)于IC10值）為0.014ng／mL。

圖1 ELISA方法檢測DMT的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The calibration curve of ELISA for DMT

2.4 準(zhǔn)確度

如表3所示，對已知DMT濃度為0.1、1、5、10、50、100ng／mL的豬肉糜樣品進(jìn)行檢測，回收率在87.41%～110.70%之間，平均回收率為100.03%；變異系數(shù)在2.05%～10.81%之間，平均變異系數(shù)為5.76%，變異系數(shù)均小于15%，說明該試劑盒是可靠的，可用于DMT在豬肉糜中殘留量的分析測定。

2.5 精密度

如表4所示，從3塊不同的酶標(biāo)板中隨機(jī)抽取4個(gè)孔，測定1ng／mL DMT標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD 450 nm值，得到的變異系數(shù)在3.16%～4.64%之間，小于15%，結(jié)果較為可靠。

我國農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的第235號文件中規(guī)定了丙酸睪酮、甲睪酮、群勃龍等類固醇激素在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量為不得檢出。因此本試驗(yàn)選取低濃度5ng／mL作為加標(biāo)濃度，結(jié)果如表5所示，得到的變異系數(shù)在6.97%～10.48%之間，小于15%，表明該試劑盒具有較好的重復(fù)性。

2.6 特異性

如表6所示，用試劑盒測得DMT與兩種結(jié)構(gòu)類似物丙酸睪酮酯、群勃龍的交叉反應(yīng)率均小于1%，說明制備的DMT酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與DMT的結(jié)構(gòu)類似物幾乎沒有交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.7 穩(wěn)定性

如表7所示，將試劑盒在4℃下保存6個(gè)月，隨著試劑盒保存期的延長，ODmax值有所下降但幅度并不高，仍為新制備試劑盒的90%，能滿足試劑盒的吸光值要求（吸光值小于0.5時(shí)，一般試劑盒不予使用）。IC50值波動(dòng)范圍為2.961ng／mL～3.206 ng／mL，波動(dòng)幅度較小，在新包被板正常的波動(dòng)幅度內(nèi)。比值ODmax／IC50變化也不大，這都說明試劑盒在4℃6個(gè)月保存期內(nèi)質(zhì)量可以保持穩(wěn)定。

表3 豬肉樣品加標(biāo)回收率Table3 Recoveries of pork samples

表4 標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性試驗(yàn)Table4 The repetition experiment of standards

表5 加標(biāo)回收的可重復(fù)性試驗(yàn)Table5 The repetition experiment of spiked recoveries

表6 交叉反應(yīng)率的測定Table6 Determination the cross－reactivity

表7 4℃保存試驗(yàn)Table7 The preservation experiment at 4℃

3 討論

DMT具有外源激素的一切特征，自20世紀(jì)50年代中期問世以來，作為生長促進(jìn)劑廣泛應(yīng)用在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中以達(dá)到大幅提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的目的。但是，消費(fèi)者長期攝入含有此類激素類藥物的動(dòng)物源性食品會(huì)導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂和性早熟，影響兒童的正常生長發(fā)育，損傷肝臟功能，同時(shí)會(huì)增加致癌、致畸的風(fēng)險(xiǎn)。早在1988年1月1日歐盟就禁止使用促生長同化激素，我國農(nóng)業(yè)部也在1988年6月30日發(fā)布的《獸藥管理?xiàng)l例實(shí)施細(xì)則》中規(guī)定“不得添加激素類藥品”。目前，檢測DMT的主要可行方法有 GC－MS[13]和 LC－MS[14]，雖然檢測準(zhǔn)確，但缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)耗力、費(fèi)用高而且樣品預(yù)處理要求較高。ELISA檢測方法具有的靈敏度高、可以在納克水平上進(jìn)行定量檢測、具有高度的特異性，同時(shí)又操作簡單等特點(diǎn)是儀器方法所無法比擬的[15]。

間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法的基本原理是抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)。本試驗(yàn)在酶標(biāo)板上包被DMT－BSA完全抗原，經(jīng)過封閉步驟后將DMT標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、抗DMT抗體先后加入微孔，溫育時(shí)，游離的DMT和固相載體上的DMT－BSA完全抗原競爭結(jié)合抗DMT抗體的結(jié)合位點(diǎn)，其中抗體與DMT－BSA完全抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后固相載體上只留下與固相抗原結(jié)合了的特異性抗體，加入酶標(biāo)二抗與固相復(fù)合物中的特異性抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地被標(biāo)記上了酶。結(jié)合了的酶可以由顯色劑顯示出來，因?yàn)槊缚梢允篃o色的顯色劑轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，反應(yīng)終止液加入后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀進(jìn)行測量，吸收光強(qiáng)度與樣品中的DMT的含量成反比。

依據(jù)上述反應(yīng)原理設(shè)計(jì)組裝了DMT－ELISA檢測試劑盒。試驗(yàn)所用DMT單抗效價(jià)達(dá)到64000，保證了試劑盒的高靈敏性；根據(jù)試劑盒采用的反對數(shù)曲線擬合成直線進(jìn)行線性定量的原理，將標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)B／B0與DMT濃度的對數(shù)值設(shè)置在同一條曲線上體現(xiàn)其線性，結(jié)果顯示工作范圍為0.1 ng／mL～100ng／mL；豬肉糜添加回收試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本試劑盒準(zhǔn)確度較高；標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)試驗(yàn)與樣品加標(biāo)回收的可重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于15%，說明該試劑盒精密度良好；采用交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定試劑盒的特異性，結(jié)果證實(shí)DMT與結(jié)構(gòu)類似物丙酸睪酮酯和群勃龍的交叉反應(yīng)率均小于1%，表明該試劑盒特異性較高；保存試驗(yàn)表明該試劑盒在4℃條件下能保持其穩(wěn)定性6個(gè)月。本試驗(yàn)研制的DMT－ELISA試劑盒既可用于DMT在動(dòng)物性食品中的殘留檢測，也為深入研究去氫甲睪酮的免疫學(xué)檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

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