吉西他濱聯(lián)合奧沙利鉑對人膽管癌裸鼠移植瘤模型的藥效實(shí)驗(yàn)研究

胡曉莉， 譚清和， 王建紅， 蘇小琴， 季進(jìn)鋒

膽管癌是一種起源于膽管上皮的惡性腫瘤，由于膽管癌的病因和發(fā)病機(jī)制不明，手術(shù)切除率低，預(yù)后差，最近研究表明歐美國家膽管癌5年生存率仍低于5%［1］。早期診斷是提高切除率的關(guān)鍵，而如何改善放化療等綜合治療的療效是決定患者能否長期生存的重要方面［2］。臨床研究已證實(shí)吉西他濱對胰腺癌具有一定的治療作用［3］，而奧沙利鉑對消化道腫瘤亦有一定的療效，兩者聯(lián)合應(yīng)用能否對膽管癌有一定療效值得探討，故本實(shí)驗(yàn)利用膽管癌細(xì)胞株建立了人膽管癌移植瘤模型，觀察吉西他濱聯(lián)合奧沙利鉑應(yīng)用對膽管癌移植瘤的抑制作用，為兩藥在臨床上的聯(lián)合應(yīng)用提供初步依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

52只4～6周裸鼠，18～22 g，雌雄兼用，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。人膽管癌細(xì)胞株(QBC939)購自武漢生物制品研究所細(xì)胞庫。實(shí)驗(yàn)藥品和試劑:吉西他濱，200 mg/瓶，Lilly公司。奧沙利鉑，50 mg/瓶，杭州賽諾菲制藥有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)液，Gibco公司。小牛血清，杭州四季青生物公司。實(shí)驗(yàn)儀器:游標(biāo)卡尺，北京量器具廠。

1.2 方法

1.2.1 人膽管癌細(xì)胞(QBC939)裸鼠模型的建立

(1)荷瘤鼠的接種:將QBC939人膽管癌細(xì)胞株置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代2～3周，離心后制成1 mL含107～108個(gè)細(xì)胞/mL的懸液(細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))。每只裸鼠左下肢皮下注射0.2 mL的瘤細(xì)胞懸液，共注射3只。(2)裸鼠移植瘤模型的建立:約1周后荷瘤鼠左下肢均出現(xiàn)瘤塊，待腫瘤長至直徑約0.8～1.0 cm時(shí)，處死其中1只，在超凈臺內(nèi)剝離出腫瘤，稍沖洗后，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，眼科剪充分剪碎，制成小瘤塊(約1 mm3)。49只裸鼠每只右下肢皮下種植小瘤塊，約2～3塊，3-0可吸收縫線縫合。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 49只荷瘤裸鼠腫塊直徑均 ＞0.8 cm時(shí)予以藥物實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)平均分成為7組，每組7只。(1)空白對照組:每只裸鼠經(jīng)腹腔注射0.3 mL生理鹽水。(2)A組(腹腔注射單倍劑量奧沙利鉑組):每只裸鼠腹腔注射0.3 mL奧沙利鉑(劑量:1.125 mg/kg)。(3)B組(腹腔注射單倍劑量吉西他濱組):每只裸鼠腹腔注射0.3 mL吉西他濱(劑量:50 mg/kg)。(4)A+B組(腹腔聯(lián)合注射單倍劑量奧沙利鉑和吉西他濱組):第1天每只裸鼠腹腔注射0.3 mL 奧沙利鉑(劑量:1.125 mg/kg)，第2 天每只裸鼠腹腔注射0.3 mL吉西他濱(劑量:50 mg/kg)。(5)2A+B(腹腔聯(lián)合注射雙倍劑量奧沙利鉑和吉西他濱組):第1天每只裸鼠腹腔注射0.3 mL奧沙利鉑(劑量:2.25 mg/kg)，余同第(4)組。(6)A+2B組(腹腔聯(lián)合注射單倍劑量奧沙利鉑和雙倍劑量吉西他濱組):第1天同第(4)組，第2天每只裸鼠腹腔注射0.3 mL吉西他濱(劑量:100 mg/kg)。(7)2A+2B組(腹腔聯(lián)合注射雙倍劑量奧沙利鉑及吉西他濱組)實(shí)驗(yàn)過程同(4)組，奧沙利鉑劑量為2.25 mg/kg，吉西他濱劑量為100 mg/kg。

1.2.3 藥效評估 每周2次測量腫瘤的長、短徑，計(jì)算體積。腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2。相對腫瘤體積(RTV)=Vt/V0(其中Vt為每一次測量時(shí)的腫瘤體積，V0為給藥時(shí)的腫瘤體積)。藥物的抗腫瘤評價(jià)指標(biāo)為相對腫瘤增殖率=(治療組RTV/對照組RTV)×100%。療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):相對腫瘤增殖率≤60%為有效，＞60%則為無效。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 治療后第24天處死裸鼠，取出移植瘤標(biāo)本，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.5 腫瘤標(biāo)志物檢測 于治療后第24天采取對照組和治療組裸鼠血樣本，采用放射免疫法測定樣本的血清CEA、CA199、CA50含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件繪制腫瘤生長曲線，統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤鼠的一般情況

荷瘤后裸鼠無特殊異狀，接種后1周局部組織水腫消失，右下肢縫合線結(jié)脫落，所有裸鼠右下肢均出現(xiàn)包塊，成瘤率100%，平均潛伏期14天。當(dāng)腫塊直徑均＞0.8 cm時(shí)予以藥物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)第1天予注射奧沙利鉑，空白對照組注射生理鹽水，第2天注射吉西他濱。藥物注射區(qū)無潰瘍發(fā)生，實(shí)驗(yàn)期間腫塊無潰瘍發(fā)生，無裸鼠死亡。實(shí)驗(yàn)第24天時(shí)處死裸鼠，行病理、細(xì)胞學(xué)檢查。

2.2 相對腫瘤增殖率的比較

給藥后第 2、5、8、11、14、17、20、24 天測量腫瘤體積，計(jì)算相對腫瘤增殖率，各組裸鼠移植瘤相對腫瘤增殖率見表1，相對腫瘤增殖率曲線見圖1。由數(shù)據(jù)可知，單用奧沙利鉑時(shí)，剛開始抑瘤效果差，但隨著時(shí)間的推移，抑瘤效果增強(qiáng)，到 d24時(shí)，為39.78%;而單用吉西他濱開始抑瘤效果好，后又較奧沙利鉑差，提示兩藥的抑瘤作用發(fā)揮于不同的時(shí)間段，兩藥聯(lián)用可發(fā)揮互補(bǔ)作用。兩藥聯(lián)用后，抑瘤效果較為穩(wěn)定，變化趨勢不大，兩藥雙倍劑量聯(lián)用抑瘤效果明顯好于單倍劑量聯(lián)用，可以推斷，兩藥聯(lián)用時(shí)抑瘤作用的發(fā)揮呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。在各時(shí)間點(diǎn)，A+2B組、2A+B組的相對腫瘤增殖率均低于A+B組，2A+2B組低于2A+B組，由此提示奧沙利鉑、吉西他濱聯(lián)用時(shí)提高奧沙利鉑或吉西他濱的劑量，均可提高抑瘤效果。

表1 裸鼠移植瘤給藥后的相對腫瘤增殖率

圖1 各組裸鼠移植瘤相對腫瘤增殖率曲線圖

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 對照組 大體觀察:移植瘤表面凹凸不平，外觀呈粉紅色，切面中心為灰白色，瘤組織質(zhì)脆易碎，中心有壞死。其他組織和臟器未見明顯轉(zhuǎn)移灶。光鏡檢查(見圖2):移植瘤組織包膜較完整，體積大，中心有壞死灶;細(xì)胞大小、形態(tài)不規(guī)則，分化程度低，有一個(gè)或多個(gè)大而不規(guī)則的圓形或橢圓形核，細(xì)胞質(zhì)相對較少，可見分裂細(xì)胞。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)組 大體觀察:移植瘤體積較對照組減小，瘤體中心壞死區(qū)域較大。光鏡檢查(見圖3):瘤細(xì)胞團(tuán)塊體積減少，瘤組織出現(xiàn)大片壞死及退變，間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤增多。

圖2 空白對照組荷瘤鼠的腫瘤病理圖(×100)

圖3 2A+2B組荷瘤鼠的腫瘤病理圖(×100)

2.4 腫瘤標(biāo)志物檢測

分別檢測對照組與2A+2B組的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA199、CA50血清含量，具體數(shù)值見表2，經(jīng) t檢驗(yàn)，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

表2 對照組與2A+2B組的腫瘤標(biāo)志物檢測情況

3 討論

早期膽管癌多無明顯的臨床癥狀，患者多因黃疸就診，手術(shù)切除率低，僅為10% ～40%［4］。大多數(shù)不能手術(shù)切除的患者只能接受內(nèi)引流、金屬內(nèi)支架、經(jīng)皮肝穿刺膽道引流等姑息性治療，雖然可以暫時(shí)緩解梗阻性黃疸、改善肝功能，但膽管的通暢只是暫時(shí)的，不能根治腫瘤。目前在膽管癌領(lǐng)域仍缺乏特效的化療藥物和方案，膽管癌患者的預(yù)后極差，因此，研究對膽管癌有效的化療藥物和方案迫在眉睫。

奧沙利鉑(oxaliplatin)為二氨環(huán)己烷的鉑類化合物。作用機(jī)制以DNA為靶作用部位，鉑原子與DNA鏈形成交聯(lián)，阻斷其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，由此殺滅腫瘤細(xì)胞，目前臨床上也已公認(rèn)奧沙利鉑對消化道腫瘤有效［5］。吉西他濱(gemcitabine)是脫氧胞嘧啶核苷的類似物，為核苷酸還原酶抑制劑。在細(xì)胞內(nèi)通過脫氧胞嘧啶核苷激酶磷酸化，轉(zhuǎn)化成具有活性的二磷酸(dFdCDP)及三磷酸核苷(dFdCTP)。dFdCDP可抑制核苷酸還原酶，致使細(xì)胞內(nèi)合成DNA所需的dCTP產(chǎn)生減少，而dFdCTP能與dCTP競爭結(jié)合DNA，兩者共同使DNA鏈延長受阻，引發(fā)細(xì)胞凋亡。已有體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吉西他濱可以作用于膽管癌細(xì)胞，延緩膽管癌細(xì)胞的生長［6］。本實(shí)驗(yàn)以膽管癌裸鼠移植瘤模型為平臺，研究奧沙利鉑與吉西他濱聯(lián)用對膽管癌的治療作用。結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用奧沙利鉑與吉西他濱第24天相對腫瘤增殖率分別為39.78%和45.73%，根據(jù)抗腫瘤藥物藥效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，奧沙利鉑與吉西他濱均對該膽管癌裸鼠模型具有抑瘤作用。當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)，抑瘤效果變化趨勢不大，且當(dāng)吉西他濱的使用劑量達(dá)到100 mg/kg時(shí)，相對腫瘤增殖率明顯降低，說明高劑量吉西他濱具有更強(qiáng)的抑瘤效果。通過病理切片觀察以及腫瘤標(biāo)志物的檢測，顯示奧沙利鉑與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對膽管癌有顯著的抑制作用，此與Andre等［7］的研究結(jié)果相一致。

吉西他濱與奧沙利鉑的聯(lián)合化療對膽管癌具有治療作用，為臨床膽管癌的化療提供了一個(gè)新的選擇和方向，但目前尚在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，最終結(jié)果還需等待臨床試驗(yàn)的開展。

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