壽胎丸提取液透過妊娠大鼠胎盤屏障的藥物成分研究

鄧麗麗 宋殿榮 胡麗萍 王躍飛

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，300150;2天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，省部共建教育部方劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3海洋石油總醫(yī)院)

壽胎丸是清代名醫(yī)張錫純所創(chuàng)，主要功能是補(bǔ)腎、養(yǎng)血、安胎，由炒菟絲子、桑寄生、川續(xù)斷、阿膠組成，現(xiàn)廣泛用于妊娠期，其藥效已得到了充分肯定［1-4］，現(xiàn)代藥理研究亦表明壽胎丸具有安胎作用［5-7］。目前對壽胎丸的研究主要集中在單味藥的化學(xué)成分、藥理作用及復(fù)方的生殖毒性方面［8-14］，對發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)未見詳細(xì)報(bào)道。運(yùn)用中藥血清藥物化學(xué)［15］方法鑒定血中的移行成分，闡明體內(nèi)直接作用物質(zhì)及體內(nèi)動態(tài)過程，可以確定中藥復(fù)方可能的藥效成分。因此，本研究通過對不同孕期Wistar大鼠灌胃STW，采用HPLC研究灌服STW后母血、臍靜脈血及胚胎組織中的藥物成分，確定透過胎盤屏障的藥物成分，闡明中藥胚胎毒性可能的物質(zhì)基礎(chǔ)，以評價(jià)妊娠期應(yīng)用的安全性。

1 材料

1.1 試藥與試劑 菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠藥材均購于安徽新興中藥材飲片有限公司，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)郭俊華教授鑒定符合國家2010年版藥典質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷、山柰酚(批號分別為:110753-200413、111521-200303、111538-200403、110861-200808，中國藥品生物制品檢定所);馬錢子苷、川續(xù)斷皂苷VI(純度＞98%，天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究院提供);甲醇(色譜純，德國Merk公司);乙腈(色譜純，德國Merk公司);乙醇(分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);甲酸(分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);純凈水(美國Millipore超純水制備系統(tǒng))。

1.2 動物 SPF級未交配過的Wistar大鼠，體重約200～220g(雌)，350 ～380g(雄)，天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，許可證編號:SCXK(津)2009-001。Wistar大鼠以雌雄1∶2比例合籠，次日清晨查看托盤內(nèi)陰道栓，將發(fā)現(xiàn)陰栓的當(dāng)日定為妊娠第0天，妊娠第6～10天、11～15天、16～20天分別為孕早、中、晚期。

1.3 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(包括自動進(jìn)樣器、DAD檢測器、Agilent色譜工作站，美國Agi-lent科技有限公司);METTLER TOLEDO AX205(十萬分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO公司);JA5003A分析天平(準(zhǔn)確稱量到1mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司);TOMOS MODEL 2-16A高速離心機(jī)(美國TOMOS公司);KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);N-EAVPTM111氮吹儀(美國Organomation公司)。

2 方法

2.1 STW的制備 精密稱取干燥的壽胎丸藥材粉末0.5g(菟絲子∶桑寄生∶續(xù)斷∶阿膠 =2∶1∶1∶1)，置 50mL具塞錐形瓶中，加入25mL75%甲醇中，超聲處理30min，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后備用。同法處理適量藥材，濃縮定容至濃度為1g(藥材)/mL提取液，置-20℃冰箱保存。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷、山柰酚、馬錢子苷、川續(xù)斷皂苷VI等標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于10mL容量瓶中，用75%甲醇溶解定容至刻度，配成濃度分別為 0.559、0.504、0.545、0.522、0.560、0.504mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，并于4℃保存。2.3 生物樣品的制備 將早、中、晚期孕鼠隨機(jī)分為2組，每組3只。實(shí)驗(yàn)組按5.4g/kg灌胃STW，對照組灌胃生理鹽水1mL/次，1次/日，各孕期連續(xù)給藥5天，末次給藥后1、12h取材。乙醚麻醉后，肝門靜脈取血1mL，臍靜脈血 0.5mL，剖宮取出胚胎組織。全血14000r/min離心10min，獲得血漿。胚胎組織以生理鹽水漂洗除去殘留血液，濾紙吸干表面水分，稱重并記錄，錫紙包裹。血漿及胚胎組織均-80℃冷凍備用。

2.4 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18(2.1mm×100mm，3.5μm);流動相:A 為0.05%甲酸水溶液，B為乙腈，(0～40min，7% ～30%B);檢測波長:254nm;流速:0.4mL/min;柱溫 40℃;進(jìn)樣量:20μL。

2.5 生物樣品處理方法 血漿、胚胎組織置于室溫條件下融化。孕早期稱取全部胚胎組織重量;隨機(jī)取孕中期及晚期胎鼠各3只，稱取胎鼠重量，按胚胎組織:生理鹽水(1g∶1mL)的比例加入生理鹽水，冰浴條件下，于勻漿器中充分勻漿。

精密吸取0.2mL血漿，加入10μL 0.1mol/L鹽酸，渦旋30s，加入甲醇1mL，渦旋1min，室溫靜置30min，14000r/min離心10min，取上清液，于40℃水浴，氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)?00μL流動相復(fù)溶，渦旋2min，14000r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣。精密吸取1mL胚胎組織勻漿液，精確分裝于5個(gè)炮彈管中，處理方法同血漿。

3 結(jié)果

灌服STW后，比對STW、空白血、母血、臍靜脈血及胚胎組織HPLC指紋圖譜。可知:給藥后1h，各孕期母血中均檢測到2個(gè)色譜峰，分別歸屬為3號峰(馬錢子苷)和8號峰(槲皮苷)，胚胎組織中未檢測到待測成分，見圖1～圖2。給藥后12h，各孕期母血、臍靜脈血及胚胎組織中均未檢測到待測成分，見圖3～圖4。

圖1 給藥1h母血HPLC圖

圖2 給藥1h臍靜脈血、胚胎組織HPLC圖

圖3 給藥12h母血HPLC圖

圖4 給藥12h臍靜脈血、胚胎組織HPLC圖2.綠原酸;3.馬錢子苷;6.金絲桃苷;8.槲皮苷;12.川續(xù)斷皂苷VI;13.山柰酚

4 討論

壽胎丸中主要含有黃酮類和生物堿類化合物，其中菟絲子及桑寄生含黃酮類物質(zhì)較多［8-9］，最佳檢測波長在 365nm［16］，續(xù)斷中環(huán)烯醚萜苷類化合物［10］的最佳檢測波長則在212nm［16］。實(shí)驗(yàn)條件下，選取360nm波長時(shí)，續(xù)斷可檢測的色譜峰少;選取212nm波長響應(yīng)高，但基線噪聲大，造成基線不穩(wěn)。而在254nm波長下三種藥物成分均有較強(qiáng)吸收，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)的測定要求。因此，最終確定紫外檢測波長為254nm。

一般黃酮類化合物(金絲桃苷、槲皮苷、山柰酚)難溶或不溶于水，偏酸性［17］。酸性物質(zhì)在胃內(nèi)的吸收率高于小腸及大腸，一般脂溶性成分易于被消化道吸收，但是藥物必須有一定的溶解度才能在消化道中很好地分散、吸收，而黃酮類物質(zhì)溶解度小，且胃內(nèi)容物會很快排至小腸及大腸，所以黃酮類物質(zhì)的生物利用度不高。環(huán)烯醚萜苷類化合物多連有極性官能團(tuán)，極性大，偏親水性［17］，不易透過消化道內(nèi)由脂質(zhì)構(gòu)成的上皮細(xì)胞膜，生物利用度差。因此實(shí)驗(yàn)中對不同孕期大鼠給藥1h后，僅母血中檢測到馬錢子苷和槲皮苷兩種物質(zhì)，可能來自川續(xù)斷和菟絲子或桑寄生;而12h母血中均未檢測到任何成分。

藥物吸收入血后，隨血液分布到機(jī)體各組織中。胎盤屏障是存在于母體與胎兒循環(huán)系統(tǒng)之間，控制母體與胎兒間的物質(zhì)流通結(jié)構(gòu)，也是藥物由母體進(jìn)入胎兒的流通結(jié)構(gòu)，可減少藥物或毒物的胎兒宮內(nèi)暴露。藥物進(jìn)入母體后，透過胎盤屏障的藥物成分須經(jīng)臍靜脈進(jìn)入胎兒體內(nèi)，對胎兒的生長發(fā)育產(chǎn)生直接影響，而未透過胎盤屏障的藥物成分對胎兒的影響可能較小。經(jīng)研究可知，實(shí)驗(yàn)劑量下，孕早、中、晚期臍靜脈血及胚胎組織中均未檢測到STW的藥物成分，提示妊娠期應(yīng)用壽胎丸不會造成胎兒的宮內(nèi)暴露，但對胎兒是否安全還需要大樣本的臨床觀察。

［1］Wramsby M L，Sten L S，Bremme K.Primary habitual abortions are associated with high frequency of Factor V Leiden mutation.Fertil Steril，2000，7(5):987-991.

［2］潘星宇.壽胎丸加味治療習(xí)慣性流產(chǎn)62例療效觀察［J］.光明中醫(yī)，2004，19(4):59-60.

［3］楊東霞，馬寶璋，曲凡，等.壽胎丸治療抗心磷脂抗體陽性致反復(fù)自然流產(chǎn)42 例［J］.中醫(yī)雜志，2006，47(11):848-849.

［4］秦文敏.反復(fù)自然流產(chǎn)的古今文獻(xiàn)及方藥證治規(guī)律研究［D］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2009:6.

［5］劉丹卓，尤昭玲，趙新廣，等.壽胎丸對大耳白孕兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性的研究［J］.湖南中醫(yī)雜志，2009，25(1):89-90.

［6］何冬梅，尤昭玲，賴毛華，等.壽胎丸對反復(fù)自然流產(chǎn)小鼠母胎界面CD4+T細(xì)胞STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，1(17):23-25.

［7］劉慧萍，尤昭玲，盧芳國，等.壽胎丸對自然流產(chǎn)模型小鼠母胎界面γ-干擾素和白介素-10基因表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27(7):1447-1449.

［8］胡麗萍，王躍飛，宋殿榮，等.HPLC-UV-M法同時(shí)測定菟絲子中5種成分的含量［J］.中草藥，2010，33(8):1277-1279.

［9］曹越，彭維，蘇薇薇，等.廣東從化桑寄生藥材的HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥材，2010，33(4):532-535.

［10］劉二偉，吳帥，樊官偉.川續(xù)斷化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(71):1421-1423.

［11］柯江維，王建紅，趙宏，等.菟絲子黃酮對心理應(yīng)激雌性大鼠海馬-下丘腦-垂體-卵巢軸性激素受體的影響［J］.中草藥，2006，37(1):90-92.

［12］丁立，錢江，張頌，等.壽胎丸的藥效學(xué)和毒理學(xué)研究［J］.中藥藥理與臨床，1997，13(5):5-8.

［13］劉丹卓，尤昭玲，趙新廣.壽胎丸對SD孕鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性的研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(12):2919-2920.

［14］彭汩.壽胎丸對大鼠妊娠期及胚胎發(fā)育生殖安全性的影響［D］.湖南中醫(yī)藥大學(xué).2009:5.

［15］王喜軍.中藥及中藥復(fù)方的血清藥物化學(xué)研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)—中藥現(xiàn)代化，2002，4(2):1-5.

［16］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:281-309.

［17］吳立軍.實(shí)用天然有機(jī)產(chǎn)物化學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:873-1001.