受體骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）對(duì)小鼠移植性動(dòng)脈硬化的影響

楊兆華 洪 濤 朱仕杰 夏利民 王春生

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心外科 上海 200032）

移植性動(dòng)脈硬化是器官移植術(shù)后主要的遠(yuǎn)期并發(fā)癥之一，常導(dǎo)致移植器官功能喪失而影響受體長(zhǎng)期存活。當(dāng)前，移植性動(dòng)脈硬化的發(fā)病機(jī)制仍不明確，臨床上也缺乏行之有效的治療方法。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）由于具有潛在的血管損傷修復(fù)功能并在多種心血管疾病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，正越來(lái)越受到研究者的重視[1－2］。近年來(lái)的多項(xiàng)研究證實(shí)，EPC同樣參與移植性動(dòng)脈硬化的發(fā)病過(guò)程[3－4］。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)：移植性動(dòng)脈硬化發(fā)病與外周血中EPC的數(shù)量明顯減少密切相關(guān)[5］。但是，通過(guò)增加EPC數(shù)量是否可以減輕移植動(dòng)脈內(nèi)膜增生從而防治移植性動(dòng)脈硬化，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)取受體同品系小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cell，MNC）經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)EPC，并輸入小鼠移植性動(dòng)脈硬化模型體內(nèi)，旨在觀察EPC對(duì)移植動(dòng)脈內(nèi)膜損傷修復(fù)及內(nèi)膜增生的影響，進(jìn)一步探討移植性動(dòng)脈硬化可能的發(fā)病機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL／6小鼠及BALB／c小鼠，雄性，體重20～25g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。

實(shí)驗(yàn)試劑及器材 M199培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；小鼠淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll液，Histopaque－1083，美國(guó)Sigma公司）；人纖維連接蛋白（natural human fibronectin，美國(guó)Biosource／Invitrogen公司）；重組小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因 子－165（vascular endothelial growth factor－165，VEGF－165，美國(guó) Peprotech公司）；DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI－ac－LDL，美國(guó) Molecular Probe公司）；FITC標(biāo)記的荊豆凝集素 （FITCUEA－1，德國(guó)Vector公司）；兔抗小鼠vWf單克隆抗體、兔抗小鼠Flk－1單克隆抗體以及免疫熒光通用SABC試劑盒（武漢博士德公司）；Evans blue染料（美國(guó)Sigma公司）；Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）。

實(shí)驗(yàn)方法

小鼠骨髓EPCs的分離、培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取BALB／c小鼠雙側(cè)股骨，PBS沖洗骨髓腔收集細(xì)胞懸液。Ficoll密度梯度離心法收集白膜層的MNC，用M199培養(yǎng)液（含20%胎牛血清及20ng／mL VEGF）將其重懸后接種于包被纖連蛋白的6孔培養(yǎng)板中，然后置于含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72h后，用PBS洗去非貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；此后，培養(yǎng)細(xì)胞每隔3天更換1次培養(yǎng)液。

DiI－ac－LDL攝取和 FITC－UEA－1結(jié)合熒光雙染法鑒定EPC 將培養(yǎng)7天的貼壁細(xì)胞在含DiI－ac－LDL（10μg／mL）的 M199培養(yǎng)液中避光孵育4h，然后以1%多聚甲醛固定細(xì)胞膜蛋白10min；PBS漂洗2次后，再加FITC－UEA－1（10μg／mL）孵育1h，最后用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。熒光顯微鏡下顯示藍(lán)色熒光為細(xì)胞核；紅色熒光為吞噬DiI－ac－LDL的細(xì)胞；綠色熒光為UEA－1染色陽(yáng)性細(xì)胞；黃色熒光為UEA－1和ac－LDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞，可認(rèn)為是正在分化的EPC。

免疫熒光染色鑒定EPC細(xì)胞表面標(biāo)記Flk－1、vWf表達(dá) 免疫熒光染色操作步驟完全按照免疫熒光SABC檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為排除假陽(yáng)性結(jié)果，PBS代替一抗設(shè)陰性對(duì)照。

小鼠腹主動(dòng)脈移植模型的建立 以C57BL／6小鼠為供體，BALB／c小鼠為受體建立小鼠同種異體腹主動(dòng)脈移植模型。首先，供體小鼠以1%戊巴比妥鈉（50mg／kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，固定于手術(shù)板上，正中開(kāi)腹并切取腎動(dòng)脈水平至髂動(dòng)脈起始水平腹主動(dòng)脈（長(zhǎng)約7mm）作為供體血管。然后，同樣方法將受體小鼠麻醉，固定四肢并正中開(kāi)腹，鈍性分離后腹膜以暴露腹主動(dòng)脈。以9－0絲線打活結(jié)分別在腎動(dòng)脈水平及腹主動(dòng)脈髂動(dòng)脈分叉水平將腹主動(dòng)脈阻斷，切除兩結(jié)扎線間的腹主動(dòng)脈。用11－0血管縫線以端端間斷吻合方式將供體腹主動(dòng)脈原位移植于受體小鼠。縫合完畢后，松開(kāi)血管上下阻斷線，待吻合口無(wú)滲血、移植血管通暢后關(guān)腹。小鼠一般術(shù)后30min蘇醒并可以自由活動(dòng)。若小鼠動(dòng)脈移植術(shù)后48h內(nèi)出現(xiàn)雙下肢癱瘓者，表明移植動(dòng)脈管腔內(nèi)或吻合口有血栓形成，視為手術(shù)失敗，排除實(shí)驗(yàn)之外。

EPC細(xì)胞移植 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，經(jīng)0.25%胰酶消化、離心后重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107／500μL備用。小鼠腹主動(dòng)脈移植術(shù)后用隨機(jī)數(shù)字法將其分為兩組：A組為對(duì)照組（n＝18），分別在模型完成后即刻、術(shù)后24h、48h依次通過(guò)尾靜脈注入500μL生理鹽水；B組為EPC輸入組（n＝18），分別在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)尾靜脈依次輸入1×107個(gè)EPCs。

掃描電鏡觀察 術(shù)后2周，A組和B組隨機(jī)各取2只小鼠處死，取出移植腹主動(dòng)脈，生理鹽水沖洗管腔后，縱形剖開(kāi)血管，置入2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）戊二醛中固定24h，再行梯度酒精脫水、醋酸異戊酯置換，臨界干燥、黏脫和鍍膜，在掃描電鏡下觀察。

Evans blue染色觀察移植血管內(nèi)皮覆蓋情況 移植術(shù)后2周，A組、B組各取8只，經(jīng)尾靜脈注射濃度為1%（質(zhì)量比）的Evans blue（25mg／kg）。30 min后處死取出移植動(dòng)脈，在生理鹽水中漂洗后，縱形剖開(kāi)血管，平鋪，暴露內(nèi)膜面，置于顯微鏡下觀察并拍照。內(nèi)皮覆蓋部分不被Evans blue著染，內(nèi)皮剝脫部分可被Evans blue染成藍(lán)色，并通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析軟件（Imgae－proplus 6.0）測(cè)定內(nèi)皮總面積和內(nèi)皮覆蓋面積。計(jì)算內(nèi)皮覆蓋面積與總面積之比，即內(nèi)皮覆蓋率。

移植動(dòng)脈病理學(xué)觀察及形態(tài)學(xué)分析 術(shù)后4周，A組和B組各取8只小鼠處死，開(kāi)胸做左心室插管，經(jīng)生理壓下灌注適量肝素生理鹽水沖洗并用4%（v／v）多聚甲醛作血管原位固定，開(kāi)腹取出移植動(dòng)脈。將動(dòng)脈經(jīng)HE染色及彈力纖維染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，并將結(jié)果輸入Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)，分別測(cè)量移植動(dòng)脈管腔面積和內(nèi)膜層面積。用血管狹窄率來(lái)反映移植動(dòng)脈的內(nèi)膜增生情況。血管狹窄率＝內(nèi)膜面積／（內(nèi)膜面積＋管腔面積）×100%。

結(jié) 果

骨髓EPC的培養(yǎng)與鑒定 新分離的骨髓MNCs顯微鏡下呈圓形，大小不一，胞體透亮，折光性好，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)72h，換液去除未貼壁細(xì)胞，見(jiàn)貼壁細(xì)胞體積增大呈紡錘形或橢圓形。培養(yǎng)至7天，貼壁細(xì)胞呈梭形，部分細(xì)胞變長(zhǎng)呈線條狀。用 DiI－ac－LDL攝取和 FITC－UEA－1結(jié)合熒光雙染法對(duì)培養(yǎng)7天細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示：綠色熒光細(xì)胞為FITC－UEA－1結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞（圖1A），紅色熒光細(xì)胞為DiI－ac－LDL攝取陽(yáng)性細(xì)胞（圖1B），黃色熒光細(xì)胞為 DiI－ac－LDL和 FITC－UEA－1雙染色陽(yáng)性細(xì)胞，被認(rèn)為是正在分化的EPC（圖1C）。藍(lán)色熒光為DAPI染色的細(xì)胞核，以此數(shù)量計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。根據(jù)黃色熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞總數(shù)的比例，計(jì)算出EPC陽(yáng)性率接近90%。用免疫熒光染色方法對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記Flk－1及vWf表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組則未見(jiàn)綠色熒光（圖1D），染色陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)綠色熒光為免疫熒光，顯示部位為胞質(zhì)和細(xì)胞膜，分別表達(dá)Flk－1（圖1E）、vWf因子（圖1F）相關(guān)抗原。

EPC對(duì)移植腹主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷修復(fù)的影響 掃描電鏡結(jié)果 A組術(shù)后2周，內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋不完整，呈蟲(chóng)蛀樣改變，嚴(yán)重部位內(nèi)皮細(xì)胞部分缺失，內(nèi)膜下組織顯露，并有炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞黏附（圖2A）；B組內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋程度顯著低于A組，部分區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞呈片狀脫落，細(xì)胞間隙增寬，可見(jiàn)內(nèi)皮缺失部位有梭形細(xì)胞黏附、覆蓋，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2B）。

Evans blue染色 注入Evans blue染液后，正常內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)損傷的腹主動(dòng)脈內(nèi)膜不被染色（即呈白色，圖3A），而內(nèi)皮細(xì)胞有損傷的血管內(nèi)膜則被染成藍(lán)色（圖3B、3C）。通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析軟件對(duì)Evans blue染色后的血管內(nèi)膜面積進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：A組內(nèi)皮覆蓋率60.57%±5.23%和B組的內(nèi)皮覆蓋率46.03%±9.09%均顯著低于正常對(duì)照（100%，P＜0.01）。其中，B組與 A組比較，內(nèi)皮覆蓋率明顯降低（P＜0.01）。

圖1 小鼠骨髓源性MNC的EPC特性鑒定Fig1 Bone marrow－derived MNCs differentiated from cells with EPC，s characteristics in mice

圖2 小鼠移植動(dòng)脈術(shù)后2周掃描電鏡照片（×300）Fig2 Scanning electron microscopy findings of mouse aortic grafts 2weeks after surgery（×300）

EPC移植對(duì)移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的影響移植術(shù)后4周小鼠腹主動(dòng)脈切片經(jīng)HE染色及彈力纖維染色后置光鏡下觀察，A組移植動(dòng)脈管壁明顯增厚，其中以內(nèi)膜增厚為主，血管管腔面積減少，血管中膜和外膜厚度則無(wú)明顯變化，外膜有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部炎癥反應(yīng)明顯（圖4A、4B）。B組移植動(dòng)脈內(nèi)膜增厚更加明顯，管腔面積較A組顯著減少（圖4C、4D）。B組移植動(dòng)脈狹窄率（57.1±4.69）%與A組（36.3±3.16）%比較有明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 小鼠移植動(dòng)脈術(shù)后2周Evans blue染色Fig3 Evans blue staining of vascular endothelial cells in mouse aortic graft 2weeks after surgery

圖4 小鼠移植動(dòng)脈術(shù)后4周病理改變（×200）Fig4 The pathological changes of mouse aortic grafts under optical microscope 4weeks after surgery（×200）

討 論

移植性動(dòng)脈硬化是慢性排斥反應(yīng)的主要病理學(xué)特征，也是目前導(dǎo)致移植物喪失功能的主要原因。然而，關(guān)于移植性動(dòng)脈硬化確切的發(fā)病機(jī)制仍未闡明。一般認(rèn)為，移植性動(dòng)脈硬化主要是由免疫因素引起，多種非免疫因素共同作用造成血管內(nèi)膜反復(fù)損傷，鄰近損傷部位的內(nèi)皮細(xì)胞和血管中層平滑肌細(xì)胞對(duì)損傷的過(guò)度修復(fù)所致。然而，近年來(lái)越來(lái)越多的研究文獻(xiàn)證實(shí)：受體循環(huán)池中的EPC也參與移植性動(dòng)脈硬化病變過(guò)程[6－8］，但具體作用仍不清楚。

本課題組前期的研究結(jié)果顯示：移植性動(dòng)脈硬化病變過(guò)程中外周血EPC數(shù)量明顯減少，提示移植性動(dòng)脈硬化的發(fā)病與外周血EPC的數(shù)量變化具有一定相關(guān)性[4］。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，移植性冠狀動(dòng)脈硬化患者外周血EPC數(shù)量顯著降低[8］。Hutter等[9］研究結(jié)果表明，當(dāng)EPC數(shù)量不足使血管機(jī)械性損傷后內(nèi)膜再內(nèi)皮化延遲，導(dǎo)致血管新生內(nèi)膜形成、管腔發(fā)生再狹窄。通過(guò)增加EPC數(shù)量可以促進(jìn)再內(nèi)皮化，減輕血管內(nèi)膜增生。那么，在移植性動(dòng)脈硬化發(fā)病過(guò)程中，增加EPC數(shù)量能否抑制移植動(dòng)脈內(nèi)膜增生，減輕移植性動(dòng)脈硬化？為了驗(yàn)證上述的假設(shè)，本研究通過(guò)建立同種異品系小鼠腹主動(dòng)脈移植模型，將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的EPC（與受體同品系）輸入到模型體內(nèi)，觀察EPC對(duì)移植血管內(nèi)膜損傷后再內(nèi)皮化及新生內(nèi)膜形成的影響。

國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，骨髓、臍血、外周血及脾臟均可培養(yǎng)出EPC[1－2］。由于骨髓中含有豐富的成體干細(xì)胞資源，其干細(xì)胞或前體細(xì)胞的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外周血，且取材方便。因此，本實(shí)驗(yàn)將骨髓作為培養(yǎng)EPC的主要來(lái)源。結(jié)果顯示：小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞在含有VEGF的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，能夠獲得形態(tài)呈梭形的內(nèi)皮樣貼壁細(xì)胞，并具有內(nèi)皮細(xì)胞的 功 能：能 夠 吞 噬 DiI－ac－LDL 和 結(jié) 合 FITCUEA－1，同時(shí)還表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志 Flk－1和vWf。證實(shí)了培養(yǎng)的細(xì)胞為EPC。

將EPC輸入小鼠移植性動(dòng)脈硬化模型2周后，掃描電鏡顯示：與手術(shù)對(duì)照組比較，輸入EPC非但沒(méi)有促進(jìn)損傷血管內(nèi)膜再內(nèi)皮化，反而進(jìn)一步加重內(nèi)膜損傷。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)血管內(nèi)膜進(jìn)行Evans blue染色，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：EPC輸入組移植動(dòng)脈血管內(nèi)皮覆蓋率明顯低于手術(shù)對(duì)照組。上述結(jié)果充分表明，增加受體來(lái)源的EPC數(shù)量并不能修復(fù)損傷內(nèi)膜，反而進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。Raemer等[10］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，EPC在一定條件下可表現(xiàn)出與單核細(xì)胞相似的特性，不但具有很強(qiáng)的抗原處理、遞呈功能，而且還可刺激T淋巴細(xì)胞分化和增殖。Lagaaij等[11］通過(guò)研究也證實(shí)，受體來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞可參與對(duì)移植物的排斥反應(yīng)。因此，結(jié)合本研究的結(jié)果，可以認(rèn)為其主要原因可能與EPC參與了受體對(duì)移植血管的免疫排斥反應(yīng)，加重受體對(duì)移植動(dòng)脈內(nèi)膜的損傷有關(guān)。

通過(guò)對(duì)移植術(shù)后4周小鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，手術(shù)對(duì)照組移植動(dòng)脈硬化明顯，表現(xiàn)為管壁厚度明顯增加，其中主要以內(nèi)膜增厚為主，血管內(nèi)外膜有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，基本符合臨床移植性動(dòng)脈硬化的病理改變特點(diǎn)。EPC輸入組與對(duì)照組相比，新生內(nèi)膜厚度明顯增加，血管狹窄率顯著提高，表明通過(guò)增加循環(huán)中EPC的數(shù)量，非但沒(méi)有抑制或減輕移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成，反而促進(jìn)移植動(dòng)脈內(nèi)膜增生，提示受體源性EPC對(duì)移植性動(dòng)脈硬化病變起促進(jìn)作用。

上述的研究表明，移植性動(dòng)脈硬化的發(fā)生并非與EPC數(shù)量不足、損傷血管內(nèi)膜再內(nèi)皮化延遲有關(guān)。相反，EPC通過(guò)參與或加強(qiáng)了受體對(duì)移植血管的免疫排斥損傷，對(duì)移植性動(dòng)脈硬化病變起促進(jìn)作用。因此，通過(guò)動(dòng)員受體骨髓EPC或輸入體外擴(kuò)增的EPC，對(duì)于防治移植性動(dòng)脈硬化并無(wú)益處。以EPC為干預(yù)靶點(diǎn)，通過(guò)減少EPC數(shù)量或抑制其生物學(xué)功能，可能成為今后防治移植性動(dòng)脈硬化的一條新途徑。

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