組蛋白去甲基化酶JARID1B的表達(dá)純化及酶活力分析

郭 雪 劉 意 楊慧蓉 徐彥輝

（1復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗室 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗室 上海 200433）

組蛋白甲基化是一種重要的翻譯后修飾，影響染色質(zhì)形成、翻譯調(diào)控及DNA損傷修復(fù)等多種生化過程。研究證實組蛋白H3上的多個賴氨酸殘基（如H3K4、H3K9、H3K27、H3K36和 H3K79）可以發(fā)生甲基化修飾，其中H3K4、H3K36和H3K79的甲基化與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，而H3K9和H3K27的甲基化則與轉(zhuǎn)錄抑制聯(lián)系[1－3］。隨著2004年第一個組蛋白去甲基化酶LSD1（lysine－specific－demethylase1）的發(fā)現(xiàn)[4］，目前為止已經(jīng)有幾十種組蛋白去甲基化酶被發(fā)現(xiàn)。這些已知的組蛋白去甲基化酶可以分為兩類：以LSD1為代表的第一類酶在發(fā)生催化反應(yīng)時需要黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）作為輔助因子；第二類含JmjC（jumonji C）結(jié)構(gòu)域的酶在去甲基化過程中需要FeⅡ和α－同戊二酸（α－ketoglutarate，α－KG）的參與[5－9］。

JARID1B（jumonji AT－rich interactive domain 1B）屬于第二類組蛋白去甲基化酶，能特異性去除H3K4的三甲基化修飾，從而抑制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄。該蛋白在乳腺癌、前列腺癌等的發(fā)生過程中起著非常重要的作用，被認(rèn)為是重要的藥物靶標(biāo)蛋白[10－11］。人源JARID1B（也稱PLU－1）蛋白序列全長1544個氨基酸殘基，包含JmjN、Arid、JmjC、Zinc－finger和3個PHD（一個位于N端，兩個位于C端）等結(jié)構(gòu)域，它是含JmjC結(jié)構(gòu)域的去甲基化酶家族中擁有結(jié)構(gòu)域種類和數(shù)量最多的成員之一。結(jié)構(gòu)功能域的多樣性與復(fù)雜性在很大程度上影響了該全長蛋白的表達(dá)和純化，本文通過軟件預(yù)測全長蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)合預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)和已知結(jié)構(gòu)功能域邊界設(shè)計新的截短體蛋白JARID1B1－825，并采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備得到大量具有酶活性的蛋白，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)與功能研究以及藥物篩選等工作奠定了基礎(chǔ)。

材料和方法

材料 E.coliTOP10及DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞由實驗室自制。pFastBacHT B質(zhì)粒和含人jarid1b目的基因的質(zhì)粒由中國科學(xué)院生化與細(xì)胞所的陳德桂老師惠贈。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；高保真的Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、dNTP、DNA marker、蛋白 marker購自日本TaKaRa生物工程有限公司；異丙基－β－D硫代半乳糖苷（IPTG）及β－半乳糖苷酶（X－gal）購自生物工程（上海）有限公司；各種抗生素購自北京賽爾曼生物技術(shù)有限公司。E.coli LB培養(yǎng)基及SOC培養(yǎng)基參照《分子克隆手冊》配制；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基SFX－insect購自美國HyClone公司。

JARID1B的截短設(shè)計 全長1544個氨基酸殘基的JARID1B包含JmjN、Arid、PHD1、JmjC、Zincfinger、PHD2和PHD3等7個結(jié)構(gòu)域（圖1）。采用PSIPRED（position specific iterated PRED）Server預(yù)測全長蛋白二級結(jié)構(gòu)，并結(jié)合已知文獻(xiàn)報道的結(jié)構(gòu)功能域邊界設(shè)計蛋白截短體。

重組Bacmid DNA的制備

重組 pFastBacHT B－jarid1b1－825質(zhì)粒的構(gòu)建以全長 JARID1B的cDNA為模板，用5′－CATCGGATCCATGGAGGCGGCCACCACACT－3′上游引物和5′－TGACCTCGAGTCATCTAGTTTGCCTTTTGCCAT－3′下游引物及高保真的Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃、20s，55℃、20s，72℃、3min，30個循環(huán)；72℃后延伸10min。純化擴(kuò)增獲得的目的DNA片段與載體pFastBacHT B分別用限制性內(nèi)切酶BamH1和Xhol在37℃雙酶切2h。將酶切后膠回收的目的基因片段和載體室溫連接1h，轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨比西林和慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。PCR篩選陽性單克隆，送美國Invitrogen公司測序。

人jarid1b1－825基因從質(zhì)粒到Bacmid的轉(zhuǎn)座將測序 正 確 的 pFastBacHT B－jarid1b1－825質(zhì)粒加入DH10BacTME.Coli感受態(tài)細(xì)胞中，冰育30min，42℃熱激45s，冰育2min，加入1mL SOC培養(yǎng)基，37℃、220r／min復(fù)蘇4h，10倍梯度稀釋，涂布于含50μg／mL卡那霉素、7μg／mL慶大霉素、10μg／mL四環(huán)素、100μg／mL X－gal和40μg／mL IPTG的LB固體平板上。37℃培養(yǎng)24～48h，直到菌落藍(lán)白斑分明，挑選白色單克隆劃線涂布在新的平板上，進(jìn)一步確定陽性白斑克隆。挑選白色單克隆入含50 μg／mL卡那霉素、7μg／mL慶大霉素和10μg／mL四環(huán)素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)14～20h，保存甘油菌，并抽提DNA。

重組bacmid DNA的抽提與鑒定 13000r／min離心5mL過夜培養(yǎng)的DH10BacTM－jarid1b1－825菌體30s，棄上清；加入250μL溶液Ⅰ（含100mg／mL的RNase A）重懸細(xì)胞沉淀至均勻；加入250μL溶液Ⅱ，輕搖5～7次，混勻，裂解細(xì)胞；加入350μL溶液Ⅲ（溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ取自索萊寶公司質(zhì)粒抽提試劑盒），輕搖8～10次，混勻；冰上放置5min，13000r／min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入等體積100%異丙醇，輕輕反復(fù)上下顛倒EP管，充分混勻，靜置5～10min，13000r／min離心15min，吸盡上清，用75%乙醇清洗DNA沉淀，13000r／min離心5min，吸盡乙醇，放置室溫，待乙醇揮發(fā)盡后加入30μL超純H2O溶解DNA。用bacmid正向引物M13F和反向引物 M13R以及jarid1b1－825的正向引物和bacmid的反向引物M13R進(jìn)行PCR鑒定，確定目的jarid1b1－825基因轉(zhuǎn)座成功。

重組bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞 取2μg轉(zhuǎn)座成功的bacmid DNA（即包含目的基因jarid1b1－825）加入到100μL不含血清和抗生素的Grace培養(yǎng)基中；另外取一EP管加入100μL不含血清和抗生素的Grace培養(yǎng)基和6μL CellfectinⅡ試劑輕輕混勻，室溫放置5min后加入到bacmid DNA溶液中，輕彈混勻，室溫放置30min。同時準(zhǔn)備Sf9昆蟲細(xì)胞：取1×106個細(xì)胞鋪入3.5cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基（不含血清和抗生素）體積為2mL，鋪板后靜置20min左右。將bacmid DNA和轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體混合液加入平皿中，27℃培養(yǎng)4h，換正常培養(yǎng)基SFX－insect，27℃培養(yǎng)72h，收P0代病毒（4000×g離心15min，上清即為病毒），4℃避光保存。轉(zhuǎn)染同時設(shè)陽性和陰性對照，陰性對照不含DNA。

取2mL P0代病毒感染40mL懸浮的Sf9昆蟲細(xì)胞，27℃、110r／min培養(yǎng)72h，收P1代病毒。再用P1代病毒以1∶1000感染Sf9細(xì)胞，得P2代病毒。

His6×－JARID1B1－825融合蛋白的表達(dá)與純化JARID1B1－825蛋白的表達(dá) P2代病毒以1∶200感染Hi5昆蟲細(xì)胞（密度為8×105），培養(yǎng)基為SFX－insect，27℃、110r／min培養(yǎng)48h，4000×g離心15min，收取細(xì)胞沉淀。

Ni－NTA親和層析純化JARID1B1－825French Press細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞，裂解緩沖液為：25mmol／L Tris／Cl（pH 8.0）、500mmol／L NaCl和2mmol／Lβ－巰基乙醇（β－mercaptoethanol，β－ME）。30000×g離心45min，上清過Ni－NTA 親和層析柱（美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)）。蛋白掛柱后，用20個柱體積的25mmol／L Tris／Cl（pH 8.0）、500mmol／L NaCl，2mmol／Lβ－ME和20mmol／L咪唑（pH 8.0）的washing緩沖液沖洗非特異結(jié)合的雜蛋白。然后用25mmol／L Tris／Cl（pH 8.0）、500mmol／L NaCl、2mmol／Lβ－ME和250mmol／L（pH 8.0）的洗脫緩沖液洗脫與Ni柱特異結(jié)合的目的蛋白JARID1B1－825。

Sourse Q陰離子交換純化JARID1B1－825將目的蛋白JARID1B1－825在低鹽緩沖液[20mmol／L Tris／Cl（pH 8.0）＋3mmol／L DTT］條件下上樣于陰離子交換柱SQ（美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)），而后梯度增加鹽濃度[高鹽緩沖液：20mmol／L Tris／Cl（pH 8.0）＋1 mol／L NaCl＋3mmol／L DTT］洗脫目的蛋白。

分子篩層析純化JARID1B1－825目的蛋白JARID1B1－825經(jīng)分子篩層析柱（美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，Superdex 20010／300GL）純化。分子篩緩沖液含10mmol／L Tris／Cl（pH8.0）、500mmol／L NaCl和3mmol／L DTT。

MALDI－TOF 分析測定JARID1B1－825的去甲基化酶活性 取10μg純化得到的高純度JARID1B1－825蛋白與1μg化學(xué)合成的多肽H3K4me3[ARTK（me3）QTARKSTGGKA］37℃反應(yīng)1h。酶活反應(yīng)緩沖液含30mmol／L Tris－HCl（pH 7.4）、150mmol／L NaCl、50μmol／L（NH4）2Fe（SO4）2、1mmol／Lα－酮戊二酸和2mmol／L抗壞血酸鹽。去甲基化酶活反應(yīng)結(jié)束后，對樣品進(jìn)行脫鹽處理：將10μL的反應(yīng)溶液過C18 Ziptip（德國Merck Millipore公司）脫鹽柱，而后用含70%乙腈和0.1%三氟乙酸的洗脫溶液洗脫掛在脫鹽柱上的多肽，送至復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院公共服務(wù)平臺進(jìn)行 MALDI－TOF（ABI 4700）質(zhì)譜分析。

結(jié) 果

JARID1B截短蛋白的設(shè)計 全長人JARID1B（GI：296439317）功能結(jié)構(gòu)域如圖1所示，去除C－端2個PHD結(jié)構(gòu)域（PHD2和PHD3）的截短蛋白JARID1B1－825含 JmjN、Arid、PHD1、JmjC 和 Zincfinger等5個密集在N－端的結(jié)構(gòu)域。

圖1 JARID1B的結(jié)構(gòu)功能域示意圖Fig1 Schematic representation of domain structure of JARID1B

重組bacmid－jarid1b1－825DNA的鑒定bacmid－Jarid1b1－825的開放式閱讀框的大小為2475bp，如果pFastBacHT B－jarid1b1－825質(zhì)粒攜帶的目的基因jarid1b1－825被成功整合到 DH10BacTME.coli的bacmid中，那么用bacmid的上游引物M13F和下游引物M13R進(jìn)行的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的DNA片段大小應(yīng)約為4900bp（2430bp＋2475bp），而用jarid1b1－825的上游引物和bacmid的下游引物M13R進(jìn)行的PCR反應(yīng)產(chǎn)物大小約為2500bp（圖2）。

圖2 重組bacmid－jarid1b1－825DNA 的 PCR 鑒定結(jié)果Fig2 The PCR verification of recombinant bacmid－jarid1－825

JARID1B1－825蛋白的表達(dá)和純化 轉(zhuǎn)染后獲得的病毒經(jīng)過2代的擴(kuò)展獲得了P2代的高毒力病毒，之后進(jìn)行不同感染濃度的檢測（1∶1000、1∶500、1∶200、1∶100），并進(jìn)行表達(dá)時間的優(yōu)化（48、60、72、84、96h），每個條件培養(yǎng)50mL細(xì)胞，進(jìn)行少量的純化檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以1∶200濃度感染并培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞獲得最高的蛋白產(chǎn)量。之后按照優(yōu)化的條件擴(kuò)大至 1L培養(yǎng)。His6×－JARID1B1－825融合蛋白的相對分子質(zhì)量應(yīng)為96.5×103，過 Ni－NTA親和層析柱得到的蛋白純度較低（圖3），為了得到純度更高的目的蛋白，進(jìn)一步采用Sourse Q陰離子交換的方法將Ni柱洗脫下來的蛋白進(jìn)行純化（JARID1B1－825的計算等電點pI 為6.22，網(wǎng)站http：／／web.expasy.org／protparam），得到純度大于90%的目的蛋白（圖4）。圖5所示的是分子篩層析得到的高純度目的蛋白JARID1B1－825。將對應(yīng)的目的條帶割膠后送質(zhì)譜鑒定確定為目的蛋白（結(jié)果未放入本文）。經(jīng)過上述純化過程后，經(jīng)UV280測濃度，獲得JARID1B1－825蛋白質(zhì)約10mg（從1L細(xì)胞培養(yǎng)得到的產(chǎn)物量，產(chǎn)率為10mg／L）。

圖3 JARID1B1－825的Ni柱親和層析純化Fig3 Purification of JARID1B1－825by Ni－NTA

圖4 JARID1B1－825的Source Q陰離子交換層析Fig4 Purification of JARID1B1－825by Source Q

圖5 JARID1B1－825的分子篩層析Fig5 Purification of JARID1B1－825by filtration

JARID1B1－825的去甲基化酶活力分析 體外合成JARID1B底物組蛋白修飾多肽 H3K4me31－15aa（ARTK（me3）QTARKSTGGKA）的理論相對分子質(zhì)量為1602.8×103，MALDI－TOF質(zhì)譜分析結(jié)果顯示其為1603.1×103（圖6A），與理論值一致。如果H3K4me31－15aa失去1個甲基基團(tuán)（－CH3），其相對分子質(zhì)量應(yīng)減去14×103（－CH2的相對分子質(zhì)量），從而變成1589.1×103；如果失去2個甲基基團(tuán)，則應(yīng)減少為1575.1×103。從加有截短蛋白JARID1B1－825的多肽質(zhì)譜分析譜圖（圖6B）中可以看到，出現(xiàn)了分別代表相對分子質(zhì)量1575.08×103和1589.15×103的峰。若以代表相對分子質(zhì)量1575.08×103峰的峰高為100%，那么代表二甲基化和三甲基化的多肽峰則均只有10%左右，也就是說，在本文所采用的反應(yīng)條件 下（10μg JARID1B1－825∶1μg H3K4me3，37℃，1h），絕大多數(shù)三甲基化的H3K4被去二甲基變成了H3K4me1。體外酶活測定實驗顯示截短的JARID1B1－825依然具有去甲基化的酶活活力，能特異催化H3K4me31－15aa多肽去一甲基和去二甲基。值得注意的是JARID1B1－825在體外沒有去me1的活性，因此催化反應(yīng)的最終產(chǎn)物為H3K4me1，與文獻(xiàn)報道一致[5－9］。

圖6 截短體JARID1B1－825的去甲基化酶活力分析Fig6 Demethylase activity analysis of JARID1B1－825

討 論

組蛋白去甲基化酶通過與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶協(xié)同作用調(diào)控著組蛋白的甲基化修飾水平，這些甲基化修飾可以被含有特定結(jié)構(gòu)域如Chromo結(jié)構(gòu)域、PHD結(jié)構(gòu)域、Tudor結(jié)構(gòu)域和WD40repeat等的效應(yīng)蛋白解讀，從而啟動下游的生物學(xué)反應(yīng)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的激活、沉默、DNA損傷修復(fù)等，廣泛參與發(fā)育分化、細(xì)胞衰老、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等細(xì)胞生物學(xué)過程[12－13］。

JARID1組蛋白去甲基化酶家族包含JARID1A／RBP2、JARID1B／PLU－1、JARID1C／SMCX和JARID1D／SMCY等4個成員，它們通過對三甲基化或二甲基化的H3K4（H3K4me3／me2）去甲基化修飾，發(fā)揮抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用[10，14－16］。JARID1A控制細(xì)胞分化[17］，調(diào)節(jié) HOX 基因 轉(zhuǎn)錄[14］；JARID1C與 X 連鎖精神發(fā)育遲滯（X－linked mental retardation，XLMR）相關(guān)[15，18］。JARID1B和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)可以被癌基因c－ErbB2顯著上調(diào)。正常生理情況下，JARID1B表達(dá)量非常低，但在導(dǎo)管性乳腺癌和前列腺癌中均可發(fā)現(xiàn)JARID1B高度表達(dá)[10－11，19］。JARID1B 的 高表達(dá)抑制了其下游14－3－3σ、BRCA1、CAV1 和HOXA5等抑癌基因的表達(dá)[10］，進(jìn)而促使腫瘤發(fā)生與發(fā)展。此外，JARID1B對乳腺癌細(xì)胞系 MCF－7的增殖和免疫缺陷小鼠乳腺癌的發(fā)生也是必需的[10］。因此，闡明JARID1B去甲基化酶的作用機制對于研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要意義。

全長1544個氨基酸殘基的人源組蛋白去甲基化酶JARID1B（相對分子質(zhì)量175.7×103）在E.coli中表達(dá)量極低且性質(zhì)不好，非常不穩(wěn)定，我們課題組曾經(jīng)嘗試多種截短該蛋白亦不能解決此問題，因此本文設(shè)計利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了它的截短蛋白。為了使其截短體盡可能擁有全長蛋白的酶活活力，本文盡可能地保留了JARID1B的功能結(jié)構(gòu)域（僅去除C－末端的2個PHD結(jié)構(gòu)域）。經(jīng)嘗試不同的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，最終從昆蟲細(xì)胞中獲得大量的目的蛋白，進(jìn)一步的去甲基化酶活實驗證實了該截短體（JARID1B1－825）具有去組蛋白甲基化的酶活性?，F(xiàn)有研究結(jié)果證實JARID1B能特異性去H3K4的三甲基化和二甲基化修飾，但其對甲基化位置和狀態(tài)的特異性選擇機制尚不清楚。本文為進(jìn)一步研究JARID1B的功能和藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。

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