MDA－MB－231細(xì)胞源exosome對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）VEGF自分泌及體外成管作用的影響

隆霜 沈宜 謝瑩珊 范維珂 姜蓉 陳黎

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室干細(xì)胞與組織工程研究室 重慶 400016）

細(xì)胞間的相互作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展、促血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用。腫瘤微環(huán)境作為保護(hù)和支持腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的必要功能單元的理論已被廣大學(xué)者接受。內(nèi)皮細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，是腫瘤血管生成的基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞分泌大量促血管生成因子，促使內(nèi)皮細(xì)胞的激活、遷移，并最終形成血管腔，不僅為原發(fā)腫瘤生長所必需，也是腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必備條件[1］。相對于已知的細(xì)胞通訊方式，目前一種起源于細(xì)胞內(nèi)吞途徑中的多泡體（multivesicular body，MVB）的膜性小囊泡exosome在細(xì)胞信息傳遞中的作用日漸受到重視[2］。

exosome是一種源于細(xì)胞內(nèi)吞途徑中的多泡體，由后者與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外的小囊泡體。新近研究表明[3－4］，exosome攜帶有大量蛋白質(zhì)、mRNA和microRNA，并能將其選擇性地遞送至受體細(xì)胞，從而在細(xì)胞間發(fā)揮多種生物學(xué)作用。本研究將人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞源exosome與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）進(jìn)行體外共培養(yǎng)，初步探討乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞源exosome對血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)及其對VEGF／VEGFR2自分泌環(huán)的作用。

材料和方法

材料人乳腺癌細(xì)胞株MDA－MB－231和HUVEC細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室提供，復(fù)蘇后使用。RPMI－1640培養(yǎng)基、DMEM高糖、新生牛血清購自Gibco公司，重水購自青島騰龍微波科技有限公司，分析純蔗糖購自上海生工生物有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、Western blot試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，人血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA定量檢測試劑盒購自美國 R＆D公司，兔抗人 VEGF、VEGFR2、p－VEGFR2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，VEGF及β－actin特異性引物由成都天泰公司合成，RNAisoTMPlus總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、PCR擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司，DNA marker、Gold view核酸染料購自北京天根公司。

細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞與HUVEC分別置含10%新生牛血清RPMI－1640與DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5%CO2培育箱內(nèi)孵育，0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集乳腺癌 MDAMB－231細(xì)胞生長對數(shù)期培養(yǎng)上清液，－20℃保存。

exosome制備及蛋白定量 參照文獻(xiàn)[5］采用低溫超速離心及密度梯度離心法提取乳腺癌MDAMB－231細(xì)胞源exosome（此法為本實驗室常規(guī)提取exosome的方法，前期實驗中已成功鑒定），0.22μm濾膜過濾分裝，－80℃保存。BCA蛋白定量法測定exosome樣品總蛋白量，步驟按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

HUVEC與exosome共培養(yǎng)體系 常規(guī)傳代HUVEC，待細(xì)胞貼壁后棄上清液，加入含終濃度為200μg／mL的exosome新鮮培養(yǎng)液，同時設(shè)置細(xì)胞對照組（無exosome處理組），繼續(xù)置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h即可做進(jìn)一步檢測。

ELISA檢測培養(yǎng)液中VEGF的含量 取對數(shù)生長期的HUVECs細(xì)胞制成5×104／mL的單細(xì)胞懸液，接種至24孔板，設(shè)對照組與實驗組，每孔1mL，37℃、5%CO2培育箱內(nèi)孵育。培養(yǎng)24h后實驗組更換含200μg／mL exosome的無血清DMEM培養(yǎng)液，對照組更換無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后收集培養(yǎng)液按ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行VEGF測定。同時將各孔進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以校正所測的吸光度值，最后根據(jù)標(biāo)本的校正吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其含量。

Western blot檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理方法及分組同前。每瓶細(xì)胞各加入200μL細(xì)胞裂解液RIPA、2μL PMSF和8μL NaF，置冰上充分裂解提取總蛋白；每泳道調(diào)整蛋白量至40μg，以10%的分離膠行SDS－PAGE電泳，蛋白質(zhì)通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含8%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉2h后，分別加入一抗（兔抗人VEGF一抗，1∶200；兔抗人 VEGFR2抗體，1∶200；兔抗人 p－VEGFR2抗體1∶200），4℃過夜，TBST溶液漂洗；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶2000），室溫孵育1h；TBST漂洗，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑于凝膠成像系統(tǒng)曝光，分析條帶灰度值。

RT－PCR檢測mRNA表達(dá) 收集1×107個細(xì)胞，加入1mL的RNAisoTMplus提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR 反 應(yīng)。VEGF上游引物序列：5′－TGCCCACTGAGGAGTCCAAC－3′，下游引物序列：5′－TGGTTCCCGAAACGCTGAG－3′，擴增片段長 度 336bp；β－actin上游引物序列：5′－CTGGGACGACATGGAGAAAA－3′，下游序列：5′－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC－3′，擴增片段長度為564bp。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性25s，59℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸10min結(jié)束PCR反應(yīng)。各取5μL產(chǎn)物與1μL 6×上樣緩沖液混勻后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30min。電泳結(jié)束后取出瓊脂糖，紫外分析儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Quantity One軟件分析凝膠灰度值。

exosome對HUVEC體外成管能力的影響Matrigel膠置于4℃冰箱過夜，使之凍融；將Matrigel膠與無血清的DMEM共300μL，以1∶1的比例加入預(yù)冷的24孔板，整個過程在冰上進(jìn)行；37℃孵育1h成膠；取對數(shù)生長期的HUVEC制成單細(xì)胞懸液，以5×105／孔的細(xì)胞接種于涂有Matrigel膠的24孔板；實驗孔加入終濃度為200μg／mL的exosome；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后取出24孔板，200倍倒置顯微鏡下隨機選取3處管腔密集處計數(shù)管腔數(shù)[6］。

結(jié) 果

exosome對HUVEC分泌VEGF的影響 乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞源exosome與HUVEC共培養(yǎng)24h，HUVEC的 VEGF分泌量為（110.851±18.404）pg／mL，較對照組（60.855±7.714）pg／mL明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 exosome對HUVEC分泌VEGF的影響Fig1 Effect of exosomes on VEGF secretion in HUVECs（1）vs.control group，P＜0.05.

Western blot檢測蛋白表達(dá) 200μg／mL乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞源exosome處理 HUVEC 24h后，VEGF、p－VEGFR2蛋白相對表達(dá)量（0.88±0.04、0.78±0.06）均明顯高于對照組（0.31±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），VEGFR2蛋白相對表達(dá)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

RT－PCR檢測VEGF mRNA表達(dá) VEGF基因RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在336bp處可見一清晰條帶。與對照組相比，200μg／mL乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞源exosome處理 HUVEC 24h后VEGF mRNA表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 Western blot檢測VEGF蛋白表達(dá)Fig2 VEGF protein expression detected by Western blot

圖3 Western blot檢測VEGFR2和p－VEGFR2蛋白表達(dá)Fig3 The expressions of VEGFR2and p－VEGFR2protein detected by Western blot

圖4 對照組與exosome實驗組VEGF mRNA RT－PCR產(chǎn)物的凝膠電泳Fig4 Electrophoresis result of RT－PCR products of VEGF mRNA in control group and exosome group

exosome對HUVEC體外成管能力的影響HUVEC在200μg／mL乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞源exosome處理24h后，exosome實驗組形成管腔數(shù)（9.4±1.07）與對照組（4.6±0.93）相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞源exosome能顯著提高HUVEC體外管腔形成能力。

圖5 exosome對HUVEC體外成管能力的影響（×200）Fig5 Effect of exosomes on capillary－like tube formation in HUVECs（×200）

討 論

腫瘤組織中豐富的血液供應(yīng)為腫瘤細(xì)胞新陳代謝提供必需的氧氣和營養(yǎng)，使腫瘤組織得以迅速的生長并為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移提供新的途徑。20世紀(jì)90年代，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)并確立VEGF是腫瘤血管生成中最為關(guān)鍵的因子，其參與了腫瘤組織血管生成的整個過程。腫瘤微環(huán)境中的VEGF主要是來源于腫瘤細(xì)胞大量分泌，而內(nèi)皮細(xì)胞自身很少分泌。內(nèi)皮細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，對腫瘤血管生成起到關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞通過分泌的VEGF以旁分泌形式刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和遷移，誘導(dǎo)血管形成，從而有利于腫瘤轉(zhuǎn)移[1］。

正常生理性血管生長過程中（如胚胎形成、骨骼生長）VEGF信號具有重要的促進(jìn)作用，同時在病理情況下也可能出現(xiàn)VEGF的異常表達(dá)?，F(xiàn)有研究表明，許多由VEGF所引起的內(nèi)皮細(xì)胞生理或病理的改變主要是由VEGFR2所介導(dǎo)，VEGF通過VEGFR2將細(xì)胞外的信號傳遞到胞內(nèi)，激活一系列下游信號通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、管狀形成，從而提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率[7］。

exosome是一種源于內(nèi)吞體系統(tǒng)并分泌到胞外、由磷脂雙分子層包圍的膜性小囊泡，其直徑為40～100nm，在電鏡下呈典型的“盤杯”狀。最初是由Pan等[8］在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程中，發(fā)現(xiàn)由網(wǎng)織紅細(xì)胞釋放的一種膜性小囊泡。exosome攜帶有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA以及microRNA，通過與受體細(xì)胞相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞，并參與多種生理及病理過程。腫瘤細(xì)胞來源的exosome在促腫瘤作用中扮演重要角色。研究表明，腫瘤細(xì)胞源exosome能誘導(dǎo)免疫耐受，下調(diào)機體的免疫監(jiān)視能力[9］。如黑色素瘤源exosome異常表達(dá)HLA－G，其通過與免疫活性細(xì)胞上的抑制分子受體結(jié)合來介導(dǎo)負(fù)向信號，抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)和CTL免疫應(yīng)答。同時還表明[10－11］，腫瘤細(xì)胞源exosome抑制 T細(xì)胞激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分及其CD3－ζ、JAK3的表達(dá)，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，并能選擇性地破壞淋巴細(xì)胞對IL－2的反應(yīng)，從而有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。另一項實驗還證明[12］，胃癌 SG7901細(xì)胞源 exosome 通過MAPK／ERK和PI3K／AKT通路促進(jìn)胃癌SGC7901細(xì)胞和另一種胃癌BGC823細(xì)胞增殖。此外，國外學(xué)者對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞源exosome與血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)研究[13］，發(fā)現(xiàn)exosome不但能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而且能進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞并相互作用。通過促血管生成相關(guān)蛋白抗體芯片檢測，發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞源exosome內(nèi)攜帶有VEGF、IL－6、IL－8、FGFα等相關(guān)蛋白，并顯著高于惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)水平。之后有學(xué)者在研究DLL4／Notch信號通路時發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)DLL4的胃癌細(xì)胞源的exosome中攜帶有DLL4，通過與HUVEC的相互作用，阻斷DLL4／Notch信號通路進(jìn)而對血管生成有一定調(diào)控作用[14］。

exosome與受體細(xì)胞相互作用的這種新的信息通訊方式已被證實。那么，腫瘤細(xì)胞源exosome在腫瘤微環(huán)境中的重要作用，特別是與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用還需深入研究。本實驗以高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞源exosome及HUVEC為研究對象，對腫瘤細(xì)胞源exosome對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用機制進(jìn)行初步探索。通過將乳腺癌MDAMB－231細(xì)胞源exosome與HUVEC進(jìn)行共培養(yǎng)，測定其對HUVEC分泌VEGF的影響及其對VEGFR2的活化作用，同時觀察其對HUVEC體外成管能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200μg／mL exosome與HUVEC共培養(yǎng)24h后，通過ELISA實驗顯示HUVEC分泌VEGF增加，與此同時，Western blot與RT－PCR實驗也分別顯示HUVEC的VEGF蛋白及mRNA均比對照組表達(dá)增加。以上實驗說明，乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞源exosome作用血管內(nèi)皮細(xì)胞后，促進(jìn)了后者VEGF的分泌。

在腫瘤促血管生成過程中，VEGF的分泌主要來源于腫瘤細(xì)胞自身。VEGF通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體VEGFR2結(jié)合并激活一系列下游信號通路而產(chǎn)生促血管生成作用，那么通過exosome的方式促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自身VEGF的分泌，是否會活化VEGFR2而激活VEGF／VEGFR2自分泌環(huán)。隨后，我們采用Western blot檢測HUVEC經(jīng)200μg／mL exosome處理24h后VEGFR2與p－VEGFR2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，HUVEC經(jīng)exosome作用后p－VEGFR2表達(dá)增加，而對照組HUVEC未見p－VEGFR2表達(dá)。同時，還通過體外成管實驗顯示HUVEC在exosome處理后其體外成管能力增強。以上結(jié)果說明了乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞源exosome作用血管內(nèi)皮細(xì)胞后，激活了血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF／VEGFR2自分泌環(huán)，對促血管生成起到一定作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF／VEGFR2信號通路是血管新生過程中關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)途徑。VEGF與VEGFR2的胞外區(qū)特異性結(jié)合后，引起受體的二聚化和自身的交互磷酸化，使胞內(nèi)特定的酪氨酸殘基磷酸化，下游信號蛋白可以通過其Src同源結(jié)構(gòu)域－2（SH2）與VEGFR2結(jié)合，隨后激活下游的效應(yīng)蛋白，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)活性。此外，2007年一篇發(fā)表于Cell雜志的文獻(xiàn)還指出[15］，內(nèi)皮細(xì)胞自分泌的VEGF對于維持內(nèi)皮細(xì)胞存活和穩(wěn)態(tài)十分重要，同時證明了自分泌的VEGF通過VEGFR2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于維持血管的內(nèi)穩(wěn)態(tài)十分關(guān)鍵。VEGF／VEGFR2的活化有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞在收到如輻射、低氧及過氧化物等刺激時維持穩(wěn)態(tài)和活力。Lee等[15］在實驗中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性VEGF敲除并未引起eNOS活性和血壓等的變化，但敲除小鼠中絕大部分都出現(xiàn)了內(nèi)出血、血栓形成和腸道穿孔等癥狀，充分說明了血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF／VEGFR2自分泌環(huán)在維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞源exosome促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的分泌，并激活VEGF／VEGFR2自分泌環(huán)，同時提高了血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管能力，提示了腫瘤細(xì)胞源exosome在促血管生成方面的重要作用。由于exosome的組成成分相當(dāng)復(fù)雜，隨著研究和認(rèn)識的深入，可能會發(fā)現(xiàn)其在腫瘤微環(huán)境中還有更多的作用，本研究同時也為腫瘤生物治療開辟了新的思路。

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