維持性血液透析（MHD）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NF－κB活性與心血管疾?。–VD）相關(guān)

徐 雁 鄒建洲 劉中華 蔣素華 徐少偉 沈 波 丁小強(qiáng)

（1上海市同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科 上海 200065；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科 上海 200032）

維持性血液透析（maintenance hemodialysis，MHD）患者心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的患病率明顯高于正常人群，且有近50%死于CVD[1］。因此，早期診斷和有效防治CVD是改善透析患者生活質(zhì)量和生存率的重要因素。近十年來(lái)，非傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如微炎癥狀態(tài)等在血透患者CVD發(fā)病中的作用越來(lái)越受到重視。核因子－κB（nuclear factor kappa B，NF－κB）是引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其與心血管疾病的關(guān)系日益得到重視[2］。但因其檢測(cè)繁瑣，長(zhǎng)期以來(lái)只用于科研。近年NF－κB的酶聯(lián)免疫吸附（enzyme－linked immunosorbant assay，ELISA）檢測(cè)方法的建立，使NF－κB高通量定量分析以及應(yīng)用于臨床炎癥狀態(tài)的敏感標(biāo)志物成為可能[3］。本文采用橫斷面研究，初步探討MHD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）NF－κB活性與CVD的關(guān)系，并與炎癥因子五聚素3（pentraxin 3，PTX3）和高敏C反應(yīng)蛋白（high sensitive C－reactive protein，hsCRP）作比較。

資料和方法

研究對(duì)象

血透患者 2010年12月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液凈化中心MHD治療的患者32例。入選標(biāo)準(zhǔn)：MHD 3個(gè)月以上；年齡＞18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月有發(fā)熱等感染征象、缺血性損傷及活動(dòng)性皮膚潰瘍等；白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10000／μL或＜4000／μL；血液系統(tǒng)疾病或腫瘤、惡病質(zhì)等；應(yīng)用靜脈鐵劑；近3個(gè)月內(nèi)曾有以下情況：消化道出血、輸血或任何原因住院；腹膜透析、腎移植轉(zhuǎn)為血透（hemodialysis，HD）者；不愿參與研究者。

CVD指既往確診心肌梗死、心絞痛、心力衰竭、腦出血、腦梗死等疾病或接受過(guò)血管重建術(shù)者（包括心臟血管和外周血管）。

健康對(duì)照組 本院體檢中心健康者12例，肝功能、腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、心電圖、胸片、腹部彩色超聲波檢查正常，無(wú)肥胖、吸煙史等。

本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

方法

臨床資料 包括年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、CVD病史及相關(guān)檢查、透析相關(guān)資料。體重指數(shù)（body mass index，BMI）＝體重（kg）／身高（m）2。用單室尿素清除指數(shù)（single pool urea clearance index，spKt／V）評(píng)價(jià)透析充分性。

實(shí)驗(yàn)室檢查 常規(guī)方法檢測(cè)血紅蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清肌酐、尿素氮、白蛋白、前白蛋白、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇及hsCRP。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）和氨基末端腦利鈉肽 前 體 （amino－terminal pro－B－natriuretic peptide，NT－proBNP）。

頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（intima－media thickness，IMT）測(cè)量 血透結(jié)束后用Philips SD800超聲儀測(cè)定IMT，探頭頻率7.5MHz?；颊哐雠P位，選擇頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端近分叉部1cm，分叉部及頸內(nèi)動(dòng)脈起始部上方1cm處后壁進(jìn)行測(cè)量。從頸根部開(kāi)始向上逐段連續(xù)觀察頸總動(dòng)脈及分叉處的橫軸和縱軸實(shí)時(shí)二維圖像，取舒張末期圖像，測(cè)量從管腔內(nèi)膜內(nèi)表面至中膜外表面的垂直距離作為頸動(dòng)脈IMT。

PBMC的NF－κB活性測(cè)定 血液透析患者于周中短周期透析的透前空腹及透析結(jié)束前10min、健康對(duì)照組晨起空腹抽血10mL，置肝素抗凝管。取血后2h內(nèi)采用密度梯度離心法分離人PBMC，提取PBMC的核蛋白。采用ELISA法檢測(cè)核蛋白NF－κB活性，根據(jù)ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物公司，產(chǎn)品號(hào)：E01N0011）說(shuō)明書(shū)操作。

血漿PTX3測(cè)定 乙二胺四乙酸抗凝管采集MHD患者周中短周期透析前空腹、透析結(jié)束前10 min及健康對(duì)照組晨起空腹外周靜脈血2mL，4℃離心后取血漿，采用ELISA法檢測(cè)PTX3。試劑盒購(gòu)自北京愛(ài)迪博公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)性變量先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。正態(tài)分布的連續(xù)變量采用表示；偏態(tài)分布的連續(xù)變量采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。人口數(shù)據(jù)用構(gòu)成比表示。用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)、兩相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗(yàn)、兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)、單因素方差分析、配對(duì)樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)比較組間差異。Pearson相關(guān)和線性回歸（逐步法）分析NF－κB活性與各指標(biāo)之間的相關(guān)性（偏態(tài)分布資料進(jìn)行自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）。二分類Logistic回歸（向前條件法）分析NF－κB活性與CVD的關(guān)系。ROC曲線評(píng)估NF－κB活性、PTX3和hsCRP與CVD的相關(guān)性。所有P值均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有可信區(qū)間為95%。

結(jié) 果

患者一般資料 共32例血液透析患者，其中男性18例，女性14例，年齡61.0（52.5～71.0）歲；健康對(duì)照組男性7例，女性5例，年齡60歲（51～70）歲。兩組的性別構(gòu)成和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共19例（59.5%）患者合并CVD，其中心肌梗死3例（15.8%），心絞痛4例（21.1%），心力衰竭4 例（21.1%），腦梗死5例（26.3%），腦出血2例（10.5%），外周血管病1例（5.3%）。

血透患者透析前后PBMC的NF－κB活性、血漿PTX3和血清hsCRP變化 血透患者PBMC的NF－κB活性、血漿PTX3和血清hsCRP皆顯著高于健康對(duì)照組，單次透析后PBMC的NF－κB活性和血漿PTX3顯著升高，血清hsCRP較透析前略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

血透患者透析前PBMC的NF－κB活性與CVD的相關(guān)性分析 合并CVD患者PBMC的NF－κB活性顯著高于非CVD患者（表2）。二分類Logistic回歸分析結(jié)果顯示透析前PBMC的NF－κB活性升高（＞1170.0ng／mg核蛋白）、年齡增長(zhǎng)及前白蛋白降低（＜0.34g／L）為 CVD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（將CVD和非CVD患者兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量作為自變量引入Logistic回歸方程，前白蛋白、血清肌酐、hsCRP、PTX3、cTnT、NT－proBNP、IMT、NF－κB以中位數(shù)為界分為2組，表3）。

表1 血透患者單次透析前后及對(duì)照組PBMC的NF－κB活性、血清hsCRP及血漿PTX3比較Tab1 NF－κB activity of PBMC，serum hsCRP and plasma PTX3in pre－and post－h(huán)emodialysis patients and controls

表2 CVD與非CVD患者透析前PBMC的NF－κB活性及相關(guān)資料比較Tab2 NF－κB activity of pre－HD patients and other characteristics and laboratory parameters in CVD and non－CVD patients（）

表2 CVD與非CVD患者透析前PBMC的NF－κB活性及相關(guān)資料比較Tab2 NF－κB activity of pre－HD patients and other characteristics and laboratory parameters in CVD and non－CVD patients（）

BMI：Body mass index；SBP：Systolic blood pressure；spKt／V：Single pool urea clearance index；Scr：Serum creatinine；BUN：Blood urea nitrogen；TG：Triglyceride；Tch：Total cholesterol；LDL－C：Low density lipoprotein cholesterol；HDL－C：High density lipoprotein cholesterol；WBC：White blood cell count；hsCRP：High sensitivity C－reactive protein；PTX3：Pentraxin3；cTnT：Cardiac troponin T；NT－proBNP：Aminoterminal pro－B－natriuretic peptide；IMT：Intima－media thickness.△1 mmHg＝0.133 kPa.

表3 血透患者CVD危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析Tab3 Binary Logistic regression analysis of independent risk factors of CVD in MHD patients

血透患者透析前PBMC的NF－κB活性的相關(guān)因素分析 17例（53.1%）MHD患者血清hsCRP升高（＞3 mg／L）。Pearson相關(guān)分析顯示PBMC的 NF－κB活性與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、hsCRP、PTX3、cTnT及IMT呈正相關(guān)（hsCRP、PTX3、cTnT及IMT進(jìn)性自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，表4）。線性回歸分析顯示白細(xì)胞計(jì)數(shù)、hsCRP、PTX3及IMT與PBMC的 NF－κB活性獨(dú)立相關(guān)（將單變量分析與NF－κB相關(guān)的變量作為自變量引入線性回歸方程，表5）。

表4 血液透析患者透析前PBMC的NF－κB活性與臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性的單變量分析Tab4 Univariate associations of NF－κB activity of pre－HD patients with relevant clinical and laboratory parameters in MHD patients （ or M△）

表4 血液透析患者透析前PBMC的NF－κB活性與臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性的單變量分析Tab4 Univariate associations of NF－κB activity of pre－HD patients with relevant clinical and laboratory parameters in MHD patients （ or M△）

△M：Median（interquartile range）.△1 mmHg＝0.133 kPa.

表5 血透患者透析前PBMC的NF－κB活性與其他指標(biāo)相關(guān)性的線性回歸分析Tab5 Linear regression analysis of associations between NF－κB activity of pre－HD patients and other laboratory parameters in MHD patients

血透患者透析前PBMC的NF－κB活性、血漿PTX3及血清hsCRP與CVD相關(guān)性的比較 針對(duì)CVD的ROC曲線分析顯示，PBMC的 NF－κB活性、PTX3和hsCRP的曲線下面積分別為0.791（95%CI：0.633～0.950，P＝0.006）、0.785（95%CI：0.628～0.943，P＝0.007）和0.711（95%CI：0.514～0.907，P＝0.046）。PBMC的 NF－κB活性與CVD的相關(guān)性略高于PTX3和hsCRP（圖1）。

圖1 MHD患者透析前PBMC的NF－κB活性、PTX3和hsCRP與CVD關(guān)系的ROC曲線Fig1 ROC curves of CVD generated with NF－κB activity，PTX3and hsCRP in pre－HD patients

討 論

NF－κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，靜息狀態(tài)下與其抑制單位IκB相結(jié)合形成復(fù)合體，以無(wú)活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，NF－κB暴露出核定位信號(hào)并進(jìn)入核內(nèi)，使其具有生物活性。活化的NF－κB可以在轉(zhuǎn)錄水平上激活多種與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子、黏附分子，是炎癥早期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[2，4］。大量研究已經(jīng)證實(shí) NF－κB為炎癥事件的敏感標(biāo)志物，但因其檢測(cè)繁瑣，較少應(yīng)用于臨床[3，5－6］。近年來(lái)隨著NF－κB檢測(cè) ELISA試劑盒的出現(xiàn)，使其高通量測(cè)定成為可能[3，7］。PTX3是近年新發(fā)現(xiàn)的炎癥因子，與CRP同屬于正五聚蛋白超家族成員，在基因組成、細(xì)胞來(lái)源和配體識(shí)別方面不同于CRP[8］。它由炎癥信號(hào)（如脂多糖、IL－1、TNF－α、氧化低密度脂蛋白、細(xì)菌產(chǎn)物等）誘導(dǎo)產(chǎn)生，在炎癥部位由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或單核巨噬細(xì)胞等合成[8－9］。在疾病過(guò)程中 PTX3升高較 CRP早。目前研究認(rèn)為PTX3可作為局部血管炎癥和心血管系統(tǒng)損傷的標(biāo)志物[10］。

本研究結(jié)果顯示MHD患者PBMC的NF－κB活性及血漿PTX3明顯高于對(duì)照組，超過(guò)半數(shù)的MHD患者血清hsCRP升高，說(shuō)明MHD患者體內(nèi)普遍存在微炎癥狀態(tài)。同時(shí)，單次透析后PBMC的NF－κB活性和血漿PTX3水平明顯高于透析前，表明HD過(guò)程可激活NF－κB，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，與以往的研究結(jié)果相符[5，7，11］。多種透析相關(guān)因素可促進(jìn)MHD患者體內(nèi)的持續(xù)低度炎癥反應(yīng)，如透析膜生物不相容、透析液污染、血管通路等[12］，并刺激細(xì)胞內(nèi)NF－κB的活化。MHD患者透析后hsCRP較透析前略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HD可能不會(huì)導(dǎo)致透析中或透析后即刻CRP的變化。因此，CRP不是反應(yīng)透析過(guò)程中炎癥變化的理想標(biāo)志物。而單次HD卻可以明顯激活PBMC的NF－κB，驗(yàn)證了NF－κB信號(hào)通路反應(yīng)迅速，表明NF－κB活化可以更早期反映炎癥反應(yīng)。單次HD后血漿PTX3也顯著升高，但升高比例低于NF－κB活性，說(shuō)明NF－κB活化早于PTX3升高。本研究結(jié)果顯示MHD患者PBMC的NF－κB活性與WBC、PTX3 及hsCRP呈正相關(guān)，說(shuō)明其可以很好地反映患者的炎癥狀態(tài)，且其反應(yīng)更迅速，可作為評(píng)價(jià)透析膜生物相容性的新指標(biāo)。

肌鈣蛋白是目前公認(rèn)的最敏感和特異的心肌損傷標(biāo)志物之一，IMT為公認(rèn)的亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)，是心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13］。本研究顯示MHD患者PBMC的NF－κB活性與cTnT及IMT呈正相關(guān)，提示MHD患者微炎癥狀態(tài)是心肌損傷及動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化本身是一種炎癥性疾病，是動(dòng)脈對(duì)內(nèi)膜損傷造成的慢性纖維增生性炎癥反應(yīng)。免疫反應(yīng)造成的血管損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原可能為自身抗原和微生物?，F(xiàn)已提出許多微生物感染與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，如巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、肺炎衣原體、幽門螺桿菌、甲型肝炎病毒以及牙周病相關(guān)微生物等。有關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化感染病因假說(shuō)的研究是近年來(lái)國(guó)際上CVD研究的熱點(diǎn)[14］。MHD患者體內(nèi)存在免疫功能失常，炎癥因子和抗炎因子的異常表達(dá)，易于引發(fā)感染，其中最主要影響因素是透析膜的生物相容性。NF－κB是引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。目前在分子水平的研究中發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化炎癥病變過(guò)程中炎癥細(xì)胞的激活和炎癥因子的釋放與NF－κB的激活密切相關(guān)[15］。普通人群的研究中發(fā)現(xiàn)PBMC的NF－κB活性與冠心病的嚴(yán)重程度相關(guān)[16］。本研究顯示 MHD患者PBMC的NF－κB活性升高是CVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，NF－κB＞1170.0ng／mg核蛋白，發(fā)生CVD的風(fēng)險(xiǎn)升高8.47倍。但因檢測(cè)方法較新，相關(guān)研究甚少，尤其在MHD患者尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，結(jié)果的穩(wěn)定性尚需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。此外，我們的研究還顯示前白蛋白降低和高齡也是CVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)不良和高齡與CVD相關(guān)，驗(yàn)證了傳統(tǒng)和非傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素在MHD患者CVD的發(fā)病中皆有重要作用。

MHD患者CVD高發(fā)，且死亡率是正常人群的30倍，大量研究證實(shí)hsCRP水平升高與CVD發(fā)病危險(xiǎn)程度密切相關(guān)[17］。本研究ROC曲線分析顯示MHD患者PBMC的NF－κB活性與CVD的相關(guān)性略高于PTX3和hsCRP，提示PBMC的NF－κB活性亦可成為檢測(cè)CVD風(fēng)險(xiǎn)的炎癥標(biāo)志物。

綜上所述，HD過(guò)程可激活PBMC的NF－κB，且PBMC的NF－κB活性與患者的炎癥及CVD的發(fā)生密切相關(guān)。但因我們的研究樣本量相對(duì)較小，結(jié)果的可靠性需在今后大樣本的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]Parfrey PS，F(xiàn)oley RN.The clinical epidemiology of cardiac disease in chronic renal failure[J］.J Am Soc Nephrol，1999，10（7）：1606－1615.

[2]Kutuk O，Basaga H.Inflammation meets oxidation：NF－κB as a mediator of initial lesion development in atherosclerosis[J］.Trends Mol Med，2003，9（12）：549－557.

[3]林青，鄭健，陳宇新，等.人外周血中NF－κB p65定量檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用[J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（7）：728－730.

[4]Ghosh S，Karin M.Missing pieces in the NF－kappa B puzzle[J］.Cell，2002，109（Suppl）：S81－S96.

[5]Menegatti E，Ronco C，Winchester JF，et al.Absence of NF－κB activation by a new polystyrene－type adsorbent designed for hemoperfusion[J］.Blood Purif，2005，23（1）：91－98.

[6]Rangan GK，Kan G，Steer JH，et al.Altered expression of nuclear factor－kB in peripheral blood mononuclear cells in chronic haemodialysis patients [J］.Nephrol Dial Transplant，2006，21（4）：1137－1139.

[7]Raj DSC，Boivin MA，Dominic EA，et al.Haemodialysis induces mitochondrial dysfunction and apoptosis[J］.Eur J Clin Invest，2007，37（12）：971－977.

[8]Garlanda C，Bottazzi B，Bastone A，et al.Pentraxins at the crossroads between innate immunity，inflammation，matrix deposition，and female fertility[J］.Annu Rev Immunol，2005，23：337－366.

[9]Basile A，Sica A，d’Aniello E，et al.Characterization of the promoter for the human long pentraxin PTX3－Role of NF－kappaB in tumor necrosis factor－alpha and interleukin－1beta regulation[J］.J Biol Chem，1997，272（13）：8172－8178.

[10]Matsui S，Ishii J，Kitagawa F，et al.Pentraxin 3in unstable angina and non－ST－segment elevation myocardial infarction[J］.Atherosclerosis，2010，210（1）：220－225.

[11]Boehme M，Kaehne F，Kuehne A，et al.Pentraxin 3is elevated in haemodialysis patients and is associated with cardiovascular disease[J］.Nephrol Dial Transplant，2007，22（8）：2224－2229.

[12]Bitla AR，Reddy PE，Manohar SM，et al.Effect of a single hemodialysis session on inflammatory markers[J］.Hemodial Int，2010，14（4）：411－417.

[13]Balsam A，Elkossi MM，Lord R，et al.Cardiovascular disease on hemodialysis：Predictors of atherosclerosis and survival[J］.Hemodial Int，2009，13（3）：278－285.

[14]Zoccali C，Mallamaci F，Tripepi G，et al.Inflammation and atherosclerosis in end－stage renal disease[J］.Blood Purif，2003，21（1）：29－36.

[15]de Winther MP，Kanters E，Kraal G，et al.Nuclear factor κB signaling in atherogenesis[J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25（5）：904－914.

[16]劉志蘋.冠心病患者外周血核因子－kappa B活性的變化及其意義[D］.山西：山西醫(yī)科大學(xué)，2008.

[17]Arici M，Walls J.End－stage renal disease，atherosclerosis，and cardiovascular mortality：Is C－reactive protein the missing link？[J］.Kidney Int，2001，59（2）：407－414.