PARG基因沉默對大腸癌CT26細(xì)胞移植瘤生長與轉(zhuǎn)移的影響

盛永濤 王婭蘭 楊 怡 王潔瓊

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心 重慶 400016）

聚腺苷二磷酸核糖基化[poly－（ADP－ribosyl）ation，PAR］是生物體內(nèi)聚腺苷二磷酸核糖多聚體在聚腺苷二磷酸核糖聚合酶催化下共價連接到接受體蛋白上去的過程，通過它實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。PAR與細(xì)胞中許多重要事件密切相關(guān)，如基因穩(wěn)定性的維持、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、DNA的修復(fù)、細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生等[1］。

聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[poly－（ADP－ribose）polymerase，PARP］和聚腺苷二磷酸核糖水解酶[poly－（ADP－ribose）glycohydrolase，PARG］是調(diào)控這一過程的兩個重要酶類。PARG是目前所知的唯一一種能在細(xì)胞核內(nèi)水解PAR的酶[2］，它對于維持PAR的動態(tài)平衡至關(guān)重要。在小鼠體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)兩種PARG亞型，即PARG110和PARG60，以PARG110尤為重要，主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)[3］。已有大量研究表明，通過抑制PARP可以降低結(jié)腸癌[4－5］、肺癌[4－5］、乳腺癌[4］、卵巢癌[4］等腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，部分研究已經(jīng)進(jìn)入到臨床試驗(yàn)階段。相比PARP，PARG對于腫瘤影響的研究目前仍限于離體實(shí)驗(yàn)。

本課題組前期的一系列離體實(shí)驗(yàn)表明[6－8］，通過藥物或慢病毒載體轉(zhuǎn)染等抑制大腸癌PARG基因的表達(dá)，可以影響PARP、AKT、NF－κb及其下游因子的表達(dá)，并進(jìn)一步降低大腸癌血管的形成、癌細(xì)胞與血小板的黏附能力、癌細(xì)胞的侵襲能力等。但目前尚無在體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來支持上述離體研究結(jié)果。基于此，本實(shí)驗(yàn)將PARG基因預(yù)先被干預(yù)的CT26細(xì)胞注射到BALB／c小鼠脾包膜下，建立大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，并用 Western blot檢測脾臟移植瘤內(nèi)PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、NF－κB p65、VEGF、FGF－2的表達(dá)，通過在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討PARG對大腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動物 BALB／c小鼠，SPF級，18只，雌性，6～8周齡，體重18～20g，動物合格證號SCXK（渝20020001），購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心并由其飼養(yǎng)。

腫瘤細(xì)胞 小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞株由四川大學(xué)魏于全教授惠贈。由美國Sigma公司提供PARG－shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染載體，并經(jīng)吳偉強(qiáng)等[9］轉(zhuǎn)染篩選，獲得PARG空載和沉默的穩(wěn)定CT26細(xì)胞株。

實(shí)驗(yàn)試劑 抗PARG抗體（英國Abcam公司），抗 PARP－1抗體、抗 P－AKT473、抗 NF－κB p65抗體、抗 VEGF抗體、抗FGF－2抗體、抗β－actin抗體（美國Santa Cruz公司），抗AKT抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），HRP標(biāo)記的兔抗羊和羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

細(xì)胞培養(yǎng) 分別常規(guī)培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染PARG－shRNA慢病毒載體的CT26細(xì)胞、轉(zhuǎn)染未搭載PARG－shRNA的慢病毒載體（空載體）的CT26細(xì)胞和轉(zhuǎn)染PARG－shRNA慢病毒載體的CT26細(xì)胞。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，制備成相應(yīng)的1×107／mL的單細(xì)胞懸液。

小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移動物模型的建立將BALB／c小鼠隨機(jī)分3組：未轉(zhuǎn)染組、PARG空載組、PARG沉默組，每組6只，分別接種相應(yīng)的CT26細(xì)胞。以未轉(zhuǎn)染組、PARG空載組為對照組，沉默組為實(shí)驗(yàn)組。參照Liu等[10］的方法：右下腹偏外側(cè)腹腔注射2%水合氯醛（0.3g／kg）麻醉BALB／c小鼠，仰臥固定，取左上腹腋中線切口進(jìn)腹，暴露脾臟，以脾膈面下極為進(jìn)針點(diǎn)，將預(yù)先制備的CT26單細(xì)胞懸液注射于脾臟包膜下，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為5×105個（即1×107／mL×50μL），止血后關(guān)腹。接種14天后處死動物，觀察脾臟移植瘤及肝轉(zhuǎn)移瘤生長及分布情況，并取脾臟移植瘤進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的檢測。腫瘤體積（v）的計算參考Huang等[11］的方法：v＝ab2／2（a：腫瘤最大直徑，b：腫瘤最小直徑），腫瘤數(shù)目為多個時間點(diǎn)計算體積之和。肝臟轉(zhuǎn)移瘤的分級參考Liu等[10］的方法分為4級：0級，肝臟轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目為0；Ⅰ級，肝臟轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目為1～5個；Ⅱ級，肝臟轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目為6～10個；Ⅲ級，肝臟轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目＞10個或腫塊融合無法計數(shù)。

Western blot檢測脾臟移植瘤組織中PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、NF－κB p65、VEGF、FGF－2的表達(dá) 取凍存的各組脾臟移植瘤組織，按試劑說明提取總蛋白、核蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。8%SDS－PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）、封閉后，用相應(yīng)目的蛋白的抗體孵育，置于4℃冰箱過夜，其中對總蛋白分別用抗PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、VEGF、FGF－2、β－actin的一抗孵育；對核蛋白用抗NF－κB p65、β－actin的一抗孵育。次日復(fù)溫0.5h后，辣根酶標(biāo)記的二抗孵育2h，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測膜上的免疫反應(yīng)條帶，BIO－RAD凝膠成像儀成像，Quantity One軟件分析。用各蛋白與對應(yīng)的內(nèi)參照β－actin的積分光密度比值作為蛋白表達(dá)的相對含量。

統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。各組脾臟轉(zhuǎn)移瘤體積及PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、NF－κB p65、VEGF、FGF－2的表達(dá)量用（）表示，用單因素方差分析。各組肝臟轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)分級后采用Kruskal－Wallis法與Nemenyi法綜合分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

各組小鼠結(jié)腸腺癌脾臟移植瘤和肝臟轉(zhuǎn)移瘤的觀察與比較 未轉(zhuǎn)染組及空載組中所有小鼠脾臟接種處均見移植瘤形成，灰白色，結(jié)節(jié)數(shù)多為單個，偶見2～3個，其中未轉(zhuǎn)染組脾臟移植瘤體積為0.988～1.913cm3?？蛰d組脾臟移植瘤體積為1.078～2.113cm3。PARG沉默組脾臟接種處均見移植瘤形成，呈灰白色，單發(fā)，體積為0.270～0.565cm3。各組小鼠的脾臟轉(zhuǎn)移瘤體積統(tǒng)計學(xué)分析顯示，未轉(zhuǎn)染組與空載組相比（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義；未轉(zhuǎn)染組與沉默組相比（P＜0.05），空載組與沉默組相比（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1、表1）。

未轉(zhuǎn)染組及空載組所有小鼠肝臟均可見灰白色多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤形成，多在30個以上，部分肝轉(zhuǎn)移瘤有融合結(jié)節(jié)形成，其他臟器未見轉(zhuǎn)移瘤。沉默組中僅部分小鼠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移瘤呈灰白色，無結(jié)節(jié)融合，其他臟器未見轉(zhuǎn)移。對肝臟轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)分級后經(jīng)統(tǒng)計學(xué)Kruskal－Wallis法與Nemenyi法綜合分析，未轉(zhuǎn)染組與空載組相比（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義；未轉(zhuǎn)染組與沉默組相比（P＜0.05），空載組與沉默組相比（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1、表1）。

圖1 各組小鼠脾臟移植瘤和肝臟轉(zhuǎn)移瘤肉眼觀Fig1 Photographs of tumor growth in the spleen and liver after transfection in various mice groups

各組小鼠脾臟移植瘤PARG、PARP－1、AKT、PAKT473、NF－κB、VEGF、FGF－2蛋白的表達(dá) 未轉(zhuǎn)染組、PARG空載組和PARG沉默組脾腫瘤的PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、NF－κB p65、VEGF、FGF－2蛋白的相對表達(dá)量見圖2、表2。除AKT外，沉默組與未轉(zhuǎn)染組其余各蛋白表達(dá)量比較（P均＜0.05），沉默組與空載組比較，P 均＜0.05，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。沉默組與對照組的總AKT表達(dá)量比較（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明PARG的改變對AKT總的表達(dá)影響不顯著。所有檢測蛋白空載組與未轉(zhuǎn)染組比較（P均＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明病毒本身對PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、NF－κB p65、VEGF、FGF－2蛋白的表達(dá)無明顯影響。

表1 各組脾臟移植瘤體積、肝臟表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)及等級Tab1 Volume of xenografted tumors in the spleen，quantity and grade of metastatic tumors in the liver after transfection in various groups （n＝6，）

表1 各組脾臟移植瘤體積、肝臟表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)及等級Tab1 Volume of xenografted tumors in the spleen，quantity and grade of metastatic tumors in the liver after transfection in various groups （n＝6，）

（1）vs.untransfected group，P＞0.05；（2）vs.untransfected group or empty vector group，P＜0.05.

表2 各組小鼠脾臟移植瘤PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、NF－κB p65、VEGF及FGF－2蛋白的表達(dá)Tab2 Expressions of PARG，PARP－1，AKT，P－AKT473，NF－κB p65，VEGF and FGF－2protein in xenografted tumors in the spleen after transfection in various groups （n＝6，）

表2 各組小鼠脾臟移植瘤PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、NF－κB p65、VEGF及FGF－2蛋白的表達(dá)Tab2 Expressions of PARG，PARP－1，AKT，P－AKT473，NF－κB p65，VEGF and FGF－2protein in xenografted tumors in the spleen after transfection in various groups （n＝6，）

vs.untransfected group or empty vector group，（1）P＜0.05，（2）P＞0.05.

討 論

圖2 各組小鼠脾臟移植瘤PARG、PARP－1、AKT、P－AKT473、NF－κB p65、VEGF及FGF－2蛋白表達(dá)的凝膠電泳Fig2 Gel electrophoresis results of PARG，PARP－1，AKT，P－AKT473，NF－κB p65，VEGF and FGF－2expressions in xenografted tumors in the spleen in various groups

PAR化是哺乳動物體內(nèi)一個重要反應(yīng)，需要PARP－1的參與。PARP結(jié)合聚ADP核糖基后處于失活狀態(tài)，PARG水解聚ADP核糖基后可使PARP再次活化[12］。PARG與PARP的動態(tài)平衡對于維持PAR循環(huán)的可持續(xù)進(jìn)行、保持受體蛋白活性穩(wěn)定必不可少。PARG表達(dá)受抑制后，能進(jìn)一步抑制PARP活性[13］。本課題組前期的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6－9］表明，在人、小鼠的大腸癌細(xì)胞中亦存在著PARG對PARP的調(diào)節(jié)。本次研究的在體試驗(yàn)結(jié)果顯示：PARG基因沉默后PARP的表達(dá)也隨之降低。提示在小鼠體內(nèi)PARG與PARP的表達(dá)有關(guān)，結(jié)果與離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6－9］一致。

當(dāng)細(xì)胞的PARP基因被敲除或被藥物抑制時，其DNA修復(fù)能力減弱，對相關(guān)損害如電離輻射、烷化劑、重金屬等的敏感性增強(qiáng)，這會使腫瘤細(xì)胞修復(fù)能力減弱，對放療、化療的敏感性增強(qiáng)，起到抗腫瘤的作用，相關(guān)離體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明這一點(diǎn)[14－15］。Min等[16］研究進(jìn)一步表明：對細(xì)胞和小鼠的PARG基因進(jìn)行抑制，能夠表現(xiàn)出與PARP沉默相同的效應(yīng)。我們前期的研究結(jié)果顯示，抑制PARP可以抑制小鼠CT26細(xì)胞脾臟移植瘤的肝轉(zhuǎn)移，PARG基因沉默可抑制人大腸癌LoVo細(xì)胞侵襲、黏附能力[7］。但PARG基因沉默是否可抑制小鼠CT26細(xì)胞脾臟移植瘤的肝轉(zhuǎn)移尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中，沉默組小鼠脾臟移植瘤大小和肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量都明顯弱于對照組，這一結(jié)果提示PARG基因沉默與小鼠大腸癌CT26細(xì)胞脾臟移植瘤的肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。

已有研究表明：PARP－1是 NF－κB通路的正性調(diào)節(jié)蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)PARP－1對NF－κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)有兩種方式：一種是通過促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)和PI3K／AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)[17］；另一種是通過抑制 PARP－NF－κB－復(fù)合物的形成來降低 NF－κB 的轉(zhuǎn)錄活性[15］。Veres等[18］對小鼠敗血病模型的研究結(jié)果進(jìn)一步表明，PARP抑制后是通過激活PI3K／AKT通路來降低NF－κB的轉(zhuǎn)錄活性。本研究結(jié)果顯示，抑制PARG后，PARP、NF－κB p65表達(dá)降低，P－AKT473表達(dá)升高，提示在大腸癌中，PARG在PI3K／AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中可能發(fā)揮了作用，這與本課題組前期對大腸癌細(xì)胞的離體研究結(jié)果[7，19］一致。

VEGF、FGF－2是已知的 NF－κB下游因子，是促血管生成（包括腫瘤血管生成）的重要因子。在腫瘤發(fā)生時，兩者均可由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生且表達(dá)明顯高于正常[20－21］。VEGF、FGF－2均可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、遷移和增生，增加血管通透性來促進(jìn)新生血管生成，部分腫瘤細(xì)胞自身尚可表達(dá)bFGFR，F(xiàn)GF－2可以通過自分泌直接刺激腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[21］。

血管生成是腫瘤生長和擴(kuò)散的關(guān)鍵步驟[22］?；诖耍狙芯吭谟^察各組脾臟移植瘤中PARG、PARP、AKT、P－AKT473、NF－κB p65表達(dá)的同時，也觀察了VEGF、FGF－2的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對照組相比，沉默組PARG表達(dá)降低在抑制PARP的同時也抑制了 NF－κB p65、VEGF、FGF－2的表達(dá)，而P－AKT473的表達(dá)則增強(qiáng)，這與本課題組前期的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7，19］是一致的。我們推測PARG可能是通過調(diào)節(jié)PARP，進(jìn)而改變PI3K／AKT、NF－κB p65的表達(dá)，最終影響 VEGF、FGF－2來降低腫瘤血管的生成，達(dá)到抑制腫瘤生長與擴(kuò)散的效應(yīng)。

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