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    DNA錯(cuò)配修復(fù)基因MSH2和MLH1單核苷酸多態(tài)性與食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究*

    2012-05-07 02:27:10何丹任鵬亮范雪嬌楊曉龍李俊葓劉琳劉戟
    四川生理科學(xué)雜志 2012年4期
    關(guān)鍵詞:核苷酸多態(tài)性基因型

    何丹 任鵬亮 范雪嬌 楊曉龍 李俊葓 劉琳 劉戟△

    (1.四川中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校藥學(xué)與檢驗(yàn)系,四川 綿陽(yáng) 621000;2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,四川 成都 610041)

    食管癌是常見(jiàn)惡性腫瘤,除飲食、環(huán)境因素外,包括乙醇代謝、葉酸代謝、致癌物代謝、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、癌基因在內(nèi)的許多基因都可能與食管癌的發(fā)生相關(guān)聯(lián),人類DNA修復(fù)機(jī)制通過(guò)保護(hù)基因組免受由內(nèi)外源性因素導(dǎo)致的各種損傷從而保持基因組穩(wěn)定性[1]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是人類遺傳變異最普遍的形式,各種證據(jù)表明DNA修復(fù)基因特定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)會(huì)影響酶的表達(dá)水平、酶活性以及個(gè)體對(duì)DNA損傷的修復(fù)效能,修復(fù)基因缺陷可能導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定和癌癥發(fā)生[2-3],暗示腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體差異與特定修復(fù)基因的多態(tài)性相關(guān)[1]。我們選擇MSH2和MLH1兩個(gè)基因作為錯(cuò)配修復(fù)基因的代表,探討其對(duì)食管癌發(fā)生的作用。

    錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair gene,MMR)是DNA修復(fù)的幾個(gè)酶系統(tǒng)之一,對(duì)保持遺傳信息的完整性和穩(wěn)定性,避免遺傳突變的產(chǎn)生具有重要作用。MSH2基因突變可引起包括結(jié)直腸癌、遺傳性無(wú)息肉病、Muir-Torre綜合征等的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)某些食管癌病人MSH2基因嚴(yán)重缺陷,其低水平表達(dá)與食管癌發(fā)生相關(guān)[4],體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSH2基因多態(tài)性可能改變其蛋白功能[5]。MLH1基因突變是以DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為標(biāo)志的大部分散發(fā)性腫瘤的特征之一,并常見(jiàn)于直腸、子宮內(nèi)膜和胃部腫瘤中。此外MLH1基因還參與有絲分裂和減數(shù)分裂的重組事件,與異源雙鏈的校正及細(xì)胞凋亡有關(guān)。但MSH2和MLH1基因與食管癌發(fā)生的關(guān)系尤其是其聯(lián)合作用在中國(guó)人群中的研究尚少見(jiàn)報(bào)道。鑒定這些DNA錯(cuò)配修復(fù)酶突變基因型與食管癌發(fā)生的相關(guān)性可能有助于闡明食管癌的病因?qū)W機(jī)制并對(duì)該疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和判斷。因此,我們進(jìn)行了一項(xiàng)基于醫(yī)院的包括169例食管癌病人和132例對(duì)照的研究,探究MSH2c.2063T>G和MLH1IVS14-19A>G兩個(gè)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    所有研究對(duì)象均為中國(guó)人群,包括2005年4月到2011年6月期間在四川省綿陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院招募的169例經(jīng)組織病理學(xué)確診的食管癌患者(不受年齡、性別、組織學(xué)類型限制,術(shù)前未經(jīng)放射和抗癌藥物治療)和132例無(wú)血緣關(guān)系的健康個(gè)體作為正常對(duì)照(主要來(lái)自于體檢者,并按性別和年齡與病例頻數(shù)配對(duì))。

    1.2 方法

    1.2.1 DNA提取

    采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“全血基因組DNA快速提取試劑盒(溶液型)”提取全血基因組DNA。

    1.2.2 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分析

    采用PCR體外擴(kuò)增目的基因片段和限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)分析(RFLP)方法檢測(cè)目的基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。引物序列設(shè)計(jì)及擴(kuò)增反應(yīng)條件和RFLP所用酶見(jiàn)表1。擴(kuò)增反應(yīng)在熱循環(huán)儀MyGeneTMSeries Peltier Thermal Cycler上進(jìn)行。酶切產(chǎn)物經(jīng)8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳,溴乙錠染色,紫外光照射下在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。病例組和對(duì)照組兩組間的人口特征差異顯著性以χ2檢驗(yàn)所得P值確定。以非條件Logistic回歸分別計(jì)算兩組等位基因及基因型頻率,通過(guò)經(jīng)年齡、性別、吸煙、飲酒、癌癥家族史等校正后的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)評(píng)估各種基因型或者基因之間交互作用與食管癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn),差異顯著性設(shè)定在P<0.05。

    表1 PCR-RFLP引物序列設(shè)計(jì)及擴(kuò)增反應(yīng)條件和酶切分析結(jié)果

    2 結(jié)果

    2.1 人口特征

    本研究中共計(jì)301個(gè)樣本,包括169例食管癌患者和132健康人。表2顯示了所研究人群主要特征。在年齡和性別分布上兩組人群沒(méi)有明顯差別(P>0.05),但是吸煙和飲酒在病例組的比例明顯高于對(duì)照組,分別是71.0%,59.8%和30.3%,32.6%,表明吸煙和飲酒是食管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素,這與通常的認(rèn)識(shí)相符,然而在癌癥家族史上兩組沒(méi)有明顯差別(P>0.05)。

    表2 病例組(169名)和對(duì)照組(132名)研究對(duì)象的人口特征分布

    2.2 單核苷酸多態(tài)性和食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)

    表3顯示了MSH2和MLH1基因在食管癌患者組及正常對(duì)照組中的等位基因與基因型頻率分布。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn),對(duì)照組所有基因型符合遺傳平衡(P>0.05),具有群體代表性。在病例組中 MSH2TT,TG和GG基因型頻率分布分別為115(68.1%),34(20.1%)和20(11.8%),與對(duì)照組差別極大,分別為122(92.4%),10(7.6%)和0。與野生型TT攜帶者相比,突變雜合子TG和純合子GG更易患食管癌(OR=5.03,95%CI=1.99-11.08,P=0.001)。對(duì)于MLH1,病例組中AA,AG,GG基因型頻率分布分別為118(69.8%),48(28.4%)和3(1.8%),與對(duì)照組也有一定差別,分別為107(81.1%),24(18.2%)和1(0.7%)。其中突變GG等位基因的攜帶者發(fā)生食管癌的風(fēng)險(xiǎn)是AA野生型純合子的2.45倍(OR=2.45,95%CI=1.39-47.78,P=0.030)。

    2.3 單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性相互作用和食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)

    由于癌癥發(fā)生發(fā)展是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的多因素參與的過(guò)程,某一通路上的基因可能會(huì)與同一通路上的其它基因作用,甚至可能與其它通路上的某些基因有交互作用,共同調(diào)節(jié)癌癥的易感性?;谙惹把芯?,MSH2和MLH1基因在一定程度上均增加了食管癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),我們進(jìn)一步探究這兩個(gè)基因之間的相互作用(見(jiàn)表4),發(fā)現(xiàn)MSH2和MLH1共同作用于食管癌的發(fā)生,且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性顯著。表4所示僅攜帶一種突變基因型的人發(fā)生食管癌的風(fēng)險(xiǎn)是正常非攜帶者的1.87到2.42倍;攜帶兩種突變基因型的人發(fā)生食管癌的風(fēng)險(xiǎn)大大增加,是正常非攜帶者的14.73倍,這一發(fā)現(xiàn)可能會(huì)對(duì)食管癌的發(fā)生提供新的線索。

    表3 MSH2和MLH1基因型頻率分布及其與食管癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

    表4 聯(lián)合分析MSH2和MLH1多態(tài)性與食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)

    3 討論

    細(xì)胞DNA容易遭受包括細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)和環(huán)境因素等的一連串打擊造成損傷,通過(guò)不同修復(fù)通路可將DNA損傷導(dǎo)致的中毒和突變的影響減到最?。?]。研究表明,DNA修復(fù)能力降低與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[1]。許多DNA修復(fù)基因具有單核苷酸多態(tài)性,導(dǎo)致氨基酸序列替代的SNP可能改變修復(fù)酶的活性,食管癌的發(fā)生發(fā)展,跟所有其他腫瘤一樣,牽涉到包括異常細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)障礙,核受體缺陷等多個(gè)基因突變[7]。在本研究中,我們分析了DNA修復(fù)基因的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn) MSH2c.2063T>G以及MLH1IVS14-19A>G與食管癌易患性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩個(gè)位點(diǎn)均使食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。

    MSH2作為錯(cuò)配修復(fù)通路上的重要組件,在特定類型的錯(cuò)誤比如新鏈DNA合成堿基配對(duì)的錯(cuò)配中起修復(fù)作用。在第13號(hào)外顯子第688位密碼子的MSH2c.2063T>G單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)位于Walker A基序,這個(gè)基序與ATP酶V型結(jié)構(gòu)域的α和β磷酸基團(tuán)相互作用,是 MSH2修復(fù)活性所必須[8]。研究證明,純化的酵母和人MSH2–MSH6復(fù)合體中這一基序中的突變導(dǎo)致該蛋白與ATP的結(jié)合和水解能力急劇下降[9],并且在大腸桿菌和酵母中非保守氨基酸的替換導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)能力的下降甚至丟失。這在本研究位點(diǎn) MSH2c.2063T>G中同樣有可能發(fā)生,隨著非極性疏水性的甲硫氨酸被一個(gè)大的帶正電荷的精氨酸替代,此結(jié)構(gòu)域由于引入了一個(gè)大的正電荷殘基可能會(huì)有結(jié)構(gòu)上的重大改變。在對(duì)宿主細(xì)胞再活化分析中,第688位Arg等位基因可能會(huì)與內(nèi)外源性致癌物導(dǎo)致的損傷修復(fù)低能有關(guān)[10]。目前對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因MSH2與食管癌關(guān)系的研究主要集中在組織蛋白表達(dá)水平。研究顯示,在食管癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在著MSH2基因的改變,其在組織中的表達(dá)下調(diào)[11]。另有報(bào)道稱該基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化明顯高于正常對(duì)照組,且甲基化程度隨疾病進(jìn)展增加,表明甲基化與MSH2基因蛋白表達(dá)缺失相關(guān),是導(dǎo)致其錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷的重要原因之一[4]。MLH1基因突變是以DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為標(biāo)志的大部分散發(fā)性腫瘤的特征之一,此外MLH1基因還參與有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)的重組事件,與異源雙鏈的校正及細(xì)胞凋亡有關(guān)。以上證據(jù)均不同程度印證了我們的結(jié)果,但仍需大量樣本量和不同種群人口研究來(lái)確證。

    MSH2和MLH1多態(tài)性聯(lián)合作用對(duì)于食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性使我們推測(cè),有這樣的可能性:兩個(gè)基因在某些水平相互作用共同維護(hù)基因組穩(wěn)定性,它們中的一個(gè)或者兩個(gè)基因缺陷可能會(huì)是食管癌的發(fā)生發(fā)展因素??傊狙芯勘砻鱉SH2c.2063G和mlH1IVS14-19G等位基因?qū)τ谑彻馨┑陌l(fā)生起到一定作用,并且MSH2和MLH1兩個(gè)多態(tài)性之間的交互作用大大增加了食管癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),表明修復(fù)基因之間可能存在一定程度的“交流”,即錯(cuò)配修復(fù)基因MSH2和MLH1多態(tài)性間共同作用調(diào)節(jié)各自在食管癌易感性上的致癌效應(yīng)。這一作用果真存在的話,對(duì)于食管癌的發(fā)生將是一項(xiàng)新的很有前景的發(fā)現(xiàn),我們將對(duì)此進(jìn)行更深入地研究,為對(duì)食管癌發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行更全面的理解、提高篩查效率以及食管癌的治療和預(yù)防將大有裨益。

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