HPLC法測(cè)定咖啡酸及咖啡酸片的含量

李明霞，張英芳，黃書芹

(1.德州德藥制藥有限公司，山東 德州 253015;2.德州市立醫(yī)院，山東 德州 253012)

咖啡酸為有機(jī)酸及酚類原料，其制劑咖啡酸片為止血升白細(xì)胞藥，具有收縮增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白細(xì)胞和血小板的作用?？Х人崤c咖啡酸片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局局頒藥品標(biāo)準(zhǔn)與衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品與制劑)第一冊(cè)，均采用紫外－分光光度法(吸收系數(shù)法)測(cè)定其含量，由于紫外－分光光度法的影響因素較多，且供試品溶液制備過程較為繁瑣，本文參照咖啡酸局頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，采用高效液相外標(biāo)法測(cè)定其含量，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC－10ATvp高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測(cè)器，Anastar色譜工作站。

1.2 試藥 咖啡酸 (由德藥制藥有限公司提供，批號(hào):111101、111201、111202);咖啡酸片(由德藥制藥有限公司提供，批號(hào):111101、111102、111103);咖啡酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110885－200102);試驗(yàn)用水為注射用水，甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜分析條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱:Sepax Sapphire C18柱(4.6mm ×250mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇 －0.32% 醋酸溶液(45∶55);檢測(cè)波長(zhǎng):323 nm;流速:1.0mL·min－1;進(jìn)樣量:10μL。理論板數(shù)按咖啡酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取咖啡酸對(duì)照品12.5mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，精密量取5mL，置25mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度。

2.2.2 供試品溶液Ⅰ(咖啡酸)的制備 取咖啡酸12.5mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，精密量取5mL，置25mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度。

供試品溶液Ⅱ(咖啡酸片)的制備:取咖啡酸片20片，精密稱定，研細(xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于咖啡酸12.5mg)，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置25mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按咖啡酸片處方比例稱取輔料適量，同法制備空白溶液。

2.3 干擾試驗(yàn) 在上述色譜條件下，取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果在對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)的位置上，供試品溶液有響應(yīng)的峰，陰性對(duì)照溶液無對(duì)應(yīng)峰，對(duì)樣品的測(cè)定無干擾，分離良好，見圖 1、2。

圖1 咖啡酸對(duì)照品色譜圖

圖2 陰性對(duì)照溶液色譜圖

2.4 線性關(guān)系及范圍 取咖啡酸對(duì)照品12.5mg，精密稱定，置50mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，分別置25mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以對(duì)照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程A=47806C－5860.5，r=0.9998(n=5)。結(jié)果表明咖啡酸在 10 ～90 μg·mL－1范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 回收率試驗(yàn) 分別取處方比例的咖啡酸對(duì)照品及空白輔料適量，照測(cè)定濃度的80%，100%，120%制備供試品溶液，每個(gè)濃度制備3份，照正文含量測(cè)定方法測(cè)定，將測(cè)得峰面積代入線性方程，計(jì)算供試品中咖啡酸的含量，回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn) 取線性試驗(yàn)中濃度為50 μg·mL－1的咖啡酸對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按咖啡酸峰面積計(jì)算得RSD=0.67%(n=6)，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)咖啡酸及咖啡酸片各6份，按正文方法測(cè)定，結(jié)果表明含量平均值分別為100.1%、99.6%，RSD 分別為0.86%、0.99%，表明本分析方法重復(fù)性較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h取10μL注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，RSD=1.06%，表明本品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品測(cè)定 按正文擬定方法分別測(cè)定3批咖啡酸及咖啡酸片的含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 咖啡酸及咖啡酸片樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相、色譜柱的選擇均參照咖啡酸局頒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果咖啡酸在323 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇323 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，可用于含量測(cè)定。

3.3 本方法線性關(guān)系試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)、精密度等試驗(yàn)均良好，適用于咖啡酸及咖啡酸片的含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)單、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。