生姜根際姜瘟病拮抗菌的篩選及鑒定

徐瑩瑩 杜秉海 丁延芹 王翠翠 王璇 姚良同

摘要：從生姜根際土樣分離獲得了65個(gè)細(xì)菌分離物和42個(gè)放線菌分離物，通過(guò)離體拮抗試驗(yàn)，篩選出對(duì)姜瘟病有良好拮抗效果的細(xì)菌一株，放線菌兩株，編號(hào)分別為H16－8、WFl和JW02－6。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定以及16S rDNA序列分析，初步確定：H16－8為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，WF1為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)，JW02-6為勞倫鏈霉菌(Streptomyces laurentii)。H16-8、WFl和JW02-6的16SrDNA序列的GenBank登錄號(hào)分別為：EU812754，F(xiàn)J972686和FJ972687。

關(guān)鍵詞：生姜根際；姜瘟?。晦卓咕?；篩選；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S476⁺.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942(2012)01-0079-05

姜瘟病主要是由青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)引起的。每年6～8月是該病發(fā)生和流行的高峰時(shí)期，此時(shí)北方正值高溫高濕天氣，是姜塊形成膨大旺盛期，病菌易侵入，侵染速度快，嚴(yán)重的可在半月左右造成全田無(wú)收，成為制約生姜優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的毀滅性病害之一。篩選抗病品種、施用化學(xué)農(nóng)藥等措施可防治姜瘟病的發(fā)生，但是輪作和篩選抗病品種周期長(zhǎng)，使用化學(xué)農(nóng)藥不僅不能從根本上防治病原菌，又帶來(lái)了環(huán)境污染。而生物防治既可限制病原菌青枯假單胞菌的生長(zhǎng)，又增加了根際有益微生物的數(shù)量和抑菌物質(zhì)的含量，是一種行之有效的方法。目前，雖然已有一些可防治姜瘟病的菌種被發(fā)現(xiàn)，但是大多存在著難以在生姜根際長(zhǎng)期定殖的問(wèn)題。

本研究討論的拮抗菌分離自生姜根際土壤，有利于其在根際的定殖，此外，拮抗菌的應(yīng)用還可以有效地促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。從山東萊蕪采集發(fā)病區(qū)生姜根際土壤樣品，篩選到對(duì)姜瘟病具有很好生防應(yīng)用潛力的細(xì)菌1株，放線菌2株，其中H16-8被鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，WF1被鑒定為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fra-diae)，JW02-6被鑒定為勞倫鏈霉菌(Streptomy-ces laurentii)。

1.材料與方法

1.1材料

生姜根際土壤樣品：采集自山東省萊蕪市。

供試病原菌：姜瘟病病原菌——青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)，由山東省萊蕪市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，細(xì)菌及放線菌菌種鑒定培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[12，13]。

試劑：分子生物學(xué)試劑購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，DNA小量快速純化試劑盒(3S SpinAgarose Gel DNA purification Kit)購(gòu)于上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2拮抗菌的篩選

分別采用細(xì)菌和放線菌培養(yǎng)所需的不同培養(yǎng)基，通過(guò)梯度稀釋法，從生姜根際土樣中分別獲得細(xì)菌和放線菌分離物。采用稀釋涂布平板法，即取100μl經(jīng)12h培養(yǎng)的病原菌菌液涂布于拮抗篩選培養(yǎng)基平板上，再將待試菌接種于培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24-48h，通過(guò)觀察抑菌圈的有無(wú)及大小進(jìn)行拮抗活性檢測(cè)，篩選出對(duì)姜瘟病病原菌具拮抗活性的細(xì)菌和放線菌，分別記錄其編號(hào)，并轉(zhuǎn)接到相應(yīng)分離培養(yǎng)基斜面上保存。

1.3菌種鑒定

形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性檢測(cè)及16SrDNA序列的擴(kuò)增方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[13，14]。

1.4DNA提取和PCR反應(yīng)

具體方法參閱文獻(xiàn)[15，16]，用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基接種拮抗菌，培養(yǎng)24h，收集菌液提取總DNA。

PCR反應(yīng)體系為：Taq DNA聚合酶0.5μl，10×Buffer(Mg²⁺)2.5μl，dNTP(10mmol/L)0.5μl，引物1μl，模板1μl，ddH₂O補(bǔ)足至25μl。

反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min；56℃1min，72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量，陜速純化試劑盒(3S spin Agarose Gel DNA purification kit)純化PCR產(chǎn)物。

1.5 16S rDNA序列測(cè)定及分析

16S rDNA的測(cè)序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，序列相似性分析通過(guò)NCBI的BLAST程序比對(duì)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，利用MEGA4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-Joining算法和Jukes-Cantor模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。自展次數(shù)設(shè)定為1000，自展檢驗(yàn)結(jié)果低于50的數(shù)值不顯示在圖上。

2.結(jié)果與分析

2.1拮抗菌的篩選

通過(guò)梯度稀釋法從生姜根際土壤樣品中篩選出65個(gè)細(xì)菌分離物和42個(gè)放線茵分離物。經(jīng)過(guò)初篩及復(fù)篩，獲得拮抗效果良好且穩(wěn)定的細(xì)菌1株，編號(hào)為H16-8；放線菌2株，編號(hào)為WF1和JW02-6。

從圖1中可以看出，H16-8、WF1和JW02-6都對(duì)Pseudomonas solanacearum具有較好的拮抗效果。

2.2形態(tài)學(xué)特征

H16-8的菌體大小為(0.50～0.55)μm×(1.10～1.20)μm，G⁺，短桿狀，產(chǎn)芽孢且孢囊膨大，在LB平板上培養(yǎng)24h后，菌落為微黃色，粘稠厚重，不透明，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣較規(guī)則。WF1孢子絲直或柔曲，孢子卵圓形或不規(guī)則圓形，表面光滑；JW02-6孢子絲直、彎曲，孢子卵圓形，表面光滑(圖2)。

2.3生理生化特性

菌株H16-8在牛肉膏蛋白胨和LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均形成微黃色不透明菌落，而在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)則形成乳白色粘稠不透明菌落；WF1和JW02-6的培養(yǎng)特性見(jiàn)表1。

H16-8、WF1和JW02-6的主要生理生化特性見(jiàn)表2和表3。其中，細(xì)菌菌株H16-8與其模式種在大多數(shù)生理生化指標(biāo)上具有相同的特征，但在pH5.5及50℃條件下的生長(zhǎng)情況與模式菌株性狀不符，說(shuō)明H16-8更耐酸、耐熱。根據(jù)放線菌的分類(lèi)和鑒定，WF1和JW02-6具有典型的鏈霉菌屬特征。其中，WF1與鏈霉菌屬弗雷德氏鏈霉菌的生物學(xué)特性相似，如弗雷德氏鏈霉菌可水解淀粉，使明膠液化和牛奶胨化，分解纖維素，硝酸鹽還原力強(qiáng)，不產(chǎn)生H₂S，但WF1不能分解纖維素，且兩者的碳源代謝不完全一致，弗雷德氏鏈霉菌可利用葡萄糖、果糖和蔗糖，而WF1僅能利用果糖。鏈霉菌屬勞倫鏈霉菌可水解淀粉，使明膠液化，可利用阿拉伯糖、果糖和甘露醇，而JW02-6能利用葡萄糖和木糖，不能利用甘露醇。篩選菌株與模式菌株之間的這些不同性狀，可能是菌株間確實(shí)存在差異，也可能是由菌株不

同生長(zhǎng)環(huán)境造成的。

2.4 16S rDNA序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像，如圖3所示。

經(jīng)測(cè)序分析，由菌株H16-8、WF1和JW02-6總DNA擴(kuò)增的16S rDNA序列長(zhǎng)分別為：1413bp，1406bp和1400bp，將得到的序列提交GenBank獲得注冊(cè)號(hào)：EU812754、FJ972686和FJ972687。

如圖4所示，H16-8位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)分支中，與Brevibacillusbrevis(AY887081)有較近的親緣關(guān)系。圖5則顯示菌株WF1和JW02-6都位于鏈霉菌屬(Strep-tomyces)分支中，分別與Streptomyces fradiae(AB184068)和Streptomyces laurentii(AB184669)有較近的親緣關(guān)系。

通過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀及生理生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析，可以初步判定拮抗細(xì)菌H16-8為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，拮抗放線菌WF1為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)，JW02-6為勞倫鏈霉菌(Streptomyces laurentii)。

3.討論與結(jié)論

生物防治可作為解決土傳病害的一條有希望的途徑。利用拮抗菌防治植物病害已被認(rèn)識(shí)和廣泛應(yīng)用，從自然界尋找和篩選新的生防菌對(duì)生物防治具有重大意義。因此，利用拮抗菌防治姜瘟病具有廣闊的應(yīng)用前景。

但一些實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)良好的生防菌株在進(jìn)行田間試驗(yàn)時(shí)，出現(xiàn)拮抗效果不穩(wěn)定的現(xiàn)象，這主要與生防菌在作物根際的定殖能力、競(jìng)爭(zhēng)作用及外界環(huán)境影響等因素有關(guān)。生防細(xì)菌防病效果取決于它在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間定殖于適當(dāng)?shù)奈恢?，并產(chǎn)生適量的抗菌物質(zhì)，不同環(huán)境條件下生防細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的量不同。本試驗(yàn)從微生物生態(tài)學(xué)角度出發(fā)，從生姜根際篩選得到了具有較好應(yīng)用潛力的3個(gè)拮抗菌菌種資源短短芽孢桿菌H16-8，弗雷德氏鏈霉菌WF1和勞倫鏈霉菌JW02-6。目前關(guān)于植物細(xì)菌性青枯病的生物防治，國(guó)內(nèi)外研究工作很多，但針對(duì)姜瘟病的研究則較少。同時(shí)，鏈霉菌可產(chǎn)生眾多次生代謝產(chǎn)物，已經(jīng)成為重要的生防菌種而被廣泛研究。而本實(shí)驗(yàn)也證明了兩株分別屬于弗雷德氏鏈霉菌和勞倫鏈霉菌的放線菌菌株對(duì)部分致病菌具有拮抗能力。

利用這些具有生防能力的菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物制備生物農(nóng)藥，具有無(wú)污染、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)所獲得拮抗菌可作為進(jìn)一步研究姜瘟病拮抗菌拮抗機(jī)制的實(shí)驗(yàn)材料，深入探討其生防機(jī)制及應(yīng)用前景，促進(jìn)高效低毒農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)利用。

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