柱穗山羊草類燕麥儲(chǔ)藏蛋白基因克隆和序列分析

杜旭燁　周婷婷　許驥坤　郭偉華　趙小龍　翟軍　孔令讓

摘 要：從小麥近緣植物柱穗山羊草中克隆得到一個(gè)特殊的類燕麥儲(chǔ)藏蛋白（Avenin-like protein）基因。其編碼區(qū)比已知的類燕麥儲(chǔ)藏蛋白編碼基因長(zhǎng)200 bp左右，是迄今發(fā)現(xiàn)的最大的類燕麥儲(chǔ)藏蛋白，將其命名為AL-Y127。通過與已知的類燕麥儲(chǔ)藏蛋白基因比較后發(fā)現(xiàn)，該蛋白家族在信號(hào)肽、N末端和C末端具有很高的保守性，而在重復(fù)區(qū)中則具有較大的序列差異。AL-Y127中有26個(gè)半胱氨酸殘基，遠(yuǎn)多于已知的avenin-like蛋白中的半胱氨酸殘基數(shù)目，這些半胱氨酸殘基可能會(huì)參與形成更多的二硫鍵，有利于提高面粉的加工品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：類燕麥儲(chǔ)藏蛋白；基因克??；序列分析

中圖分類號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）11-0001-05

Cloning and Sequence Analysis of Novel Avenin-Like Genes

from Aegilops cylindrical

Du XuYe1， 2， Zhou TingTing1， Xu JiKun1， Guo WeiHua1，

Zhao XiaoLong1， Zhai Jun1， 2， Kong LingRang1， 2*

（1.Agronomy College， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；

2.State Key Laboratory of Crop Biology， Taian 271018， China）

Abstract A novel avenin-like gene was cloned from Aegilops cylindrical. Its coding region the gene was 200 bp longer than that of published avenin-like gene and it was named AL-Y127. This gene is the largest avenin-like gene so far. It showed that the signal peptide， N-terminal domain and C-terminal domain of avenin-like protein were highly conservative by comparing AL-Y127 and the other published avenin-like proteins. The repetitive domain displayed more variation based on protein sequence alignment. There were 26 cysteine residues in AL-Y127， which were much more than these of the avenin-like proteins in other species； they may form more disulfide bond which have the positive role in the processing quality of flour.

Key words Avenin-like proteins； Clone； Sequence analysis

小麥籽粒的儲(chǔ)藏蛋白主要包括谷蛋白和醇溶蛋白，谷蛋白是多聚體蛋白，由分子內(nèi)部的二硫鍵結(jié)合形成蛋白聚合體；而醇溶蛋白是一類單體蛋白，根據(jù)其在酸性電泳中的遷移率可以分為α、γ和ω醇溶蛋白三類。

類燕麥儲(chǔ)藏蛋白是最近幾年引起人們關(guān)注的一類儲(chǔ)藏蛋白。最初，Salcedo等[1]報(bào)道了一種低分子量的醇溶蛋白，隨后Anderson和Clarke[2，3]得到了此類蛋白的cDNA序列，Kan等[4]分析后認(rèn)為此類蛋白與燕麥種子的儲(chǔ)藏蛋白具有最近的親緣關(guān)系，因此將其命名為類燕麥儲(chǔ)藏蛋白（Aevnin-like protein）。根據(jù)其結(jié)構(gòu)可將其分為兩類：a型和b型類燕麥儲(chǔ)藏蛋白。

序列分析表明，a型類燕麥儲(chǔ)藏蛋白類似于低分子量谷蛋白亞基，通過蛋白組學(xué)分析和蛋白質(zhì)分離已經(jīng)得到了該類型的類燕麥儲(chǔ)藏蛋白。目前對(duì)b型類燕麥儲(chǔ)藏蛋白的研究較少，Kan等[4]發(fā)現(xiàn)，一些b型類燕麥儲(chǔ)藏蛋白中含有19個(gè)半胱氨酸殘基，認(rèn)為它們可以通過分子鏈內(nèi)的二硫鍵結(jié)合到谷蛋白聚合體中。

柱穗山羊草（CCDD）是小麥的近緣植物之一，由于其外形與粗山羊草十分相似，因此常常被誤認(rèn)為是粗山羊草。目前對(duì)它的研究較少。本文從柱穗山羊草中克隆得到了一個(gè)特殊的類燕麥儲(chǔ)藏蛋白基因，并對(duì)其編碼序列及氨基酸序列進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

11 供試材料

柱穗山羊草京Y127，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。Trans T1感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T1克隆載體、Hifi Taq高保真酶均購(gòu)于北京全式金公司?；蚪MDNA提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。

12 方法

121 基因組DNA提取 以室內(nèi)生長(zhǎng)2周的幼葉為材料，利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，操作方法依照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。

122 基因克隆及序列測(cè)定 根據(jù)GenBank公布的avenin-like蛋白編碼基因的保守序列（表1）

表1

引物設(shè)計(jì)的參考序列

基因來源 GenBank登錄號(hào)

小傘山羊草 EU096528

柱穗山羊草 EU096537

長(zhǎng)穗偃麥草 EU096540

雙角山羊草 EU096546

普通小麥 HM027637

普通小麥 JN542459

設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列如下：P1：5′-ATGAAGGTCTTCATCCTGGCT-3′；P2：5′-CTAGCACGCACCACCAGT-3′。該引物可覆蓋avenin-like蛋白編碼基因的起始密碼子至終止密碼子的編碼區(qū)。

123 序列分析 利用http：//webexpasyorg/translate/在線工具進(jìn)行氨基酸序列的翻譯；DNAMAN 60軟件用于序列的多重比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

21 柱穗山羊草類燕麥儲(chǔ)藏蛋白基因的PCR擴(kuò)增

利用特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得了一條大小約為1 000 bp的條帶（圖1），經(jīng)菌落PCR鑒定后（圖2），隨機(jī)選擇10個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)多重序列比對(duì)后，確定得到兩個(gè)avenin-like蛋白編碼基因，其中一個(gè)為從未報(bào)道過的新基因，命名為AL-Y127。

注：1，DNA ladder；2，avenin-like蛋白編碼基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

22 與已知序列的比較分析

經(jīng)過與已知的avenin-like蛋白編碼基因進(jìn)行比較（表2）發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)所得到的編碼基因長(zhǎng)

注：M，DNA ladder；1～12， 菌落PCR產(chǎn)物，其中泳道12為AL-Y127。

圖2 菌落PCR

度大于已知的此類基因，同時(shí)其半胱氨酸的殘基數(shù)目較多，為26個(gè)，而在已知的avenin-like蛋白編碼基因中，半胱氨酸殘基數(shù)目最多為19個(gè)。因此，本試驗(yàn)得到的蛋白可以形成更多的二硫鍵，有利于提高面粉的加工品質(zhì)。

與已知的avenin-like蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖3）發(fā)現(xiàn)，此類蛋白有保守的信號(hào)肽、N-末端以及C-末端，而主要的變異幾乎全部來自重復(fù)區(qū)。只是AL-Y127的重復(fù)區(qū)更長(zhǎng)。

表2 AL-Y127與已知類燕麥儲(chǔ)藏蛋白的

序列比較

蛋 白 氨基酸數(shù)目 半胱氨酸殘基數(shù)目 等電點(diǎn) 分子量（ku）

AL-Y127 404 26 696 4624

EU096528 284 18 783 3233

EU096537 284 18 843 3233

EU096540 284 18 783 3233

EU096547 284 19 781 3201

HM027637 284 18 783 3236

JN542459 284 18 741 3239

注：Ⅰ，信號(hào)肽；Ⅱ，N-末端；Ⅲ，重復(fù)區(qū)；IV，C-末端；箭頭，保守的半胱氨酸殘基；方框，AL-Y127中額外的半胱氨酸殘基。

圖3 AL-Y127與已知的avenin-like蛋白多重序列比對(duì)

3 討論與結(jié)論

為了研究柱穗山羊草中的avenin-like蛋白，本試驗(yàn)從柱穗山羊草京Y127中分離出一個(gè)迄今未見報(bào)道的高分子量的avenin-like蛋白，其編碼基因?yàn)? 212 bp，表達(dá)的蛋白質(zhì)由404個(gè)氨基酸殘基組成，比已知的avenin-like蛋白的氨基酸多100多個(gè)；其半胱氨酸殘基的數(shù)目多達(dá)26個(gè)，比同家族的蛋白多8個(gè)左右，比大多數(shù)的高分子量谷蛋白亞基多約20個(gè)。陳瑞佶等[5]認(rèn)為，avenin-like蛋白中的半胱氨酸殘基所形成的二硫鍵既可以形成分子內(nèi)二硫鍵，也可以和其他的儲(chǔ)藏蛋白形成分子間二硫鍵。目前對(duì)小麥儲(chǔ)藏蛋白中二硫鍵的作用已經(jīng)形成了廣泛的共識(shí)，即二硫鍵的數(shù)目和位置會(huì)直接影響面粉的加工品質(zhì)，因此，avenin-like蛋白對(duì)改良小麥品質(zhì)具有重要的潛力。

Salvatore等[6]認(rèn)為，avenin-like蛋白作為小麥的儲(chǔ)藏蛋白，與已知的小麥儲(chǔ)藏蛋白表現(xiàn)出一些共性，例如在其編碼基因的結(jié)構(gòu)上，兩端均為保守序列，變異發(fā)生在重復(fù)區(qū)中。本試驗(yàn)的多重序列比對(duì)表明（圖3），AL-Y127與已知的avenin-like蛋白序列的差異主要體現(xiàn)在重復(fù)區(qū)中，而在信號(hào)肽、N末端以及C末端的序列則相對(duì)保守。陳鵬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，avenin-like蛋白基因?qū)儆诙嗷蚣易?，因此，上述的分子結(jié)構(gòu)為此類基因的同源克隆創(chuàng)造了條件，利于從更多的材料中克隆出該基因并進(jìn)行功能分析。

本試驗(yàn)克隆獲得的avenin-like蛋白基因具有高分子量以及高半胱氨酸含量，其結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白為一個(gè)優(yōu)質(zhì)蛋白，而對(duì)于其具體的功能以及利用該蛋白改良小麥的品質(zhì)還有待于進(jìn)一步的研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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