天女木蘭組織培養(yǎng)的抗褐化研究

王歡 杜鳳國 張志翔 齊翠翠

摘要：從外植體類型、外植體預(yù)處理方法、培養(yǎng)基類型、抗褐化劑類型及培養(yǎng)條件等方面研究了天女木蘭（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ Ｋ． Ｋｏｃｈ）組織培養(yǎng)過程中的褐化問題。結(jié)果表明，Ｂ５培養(yǎng)基對(duì)防止外植體褐化效果好，外植體在ＭＳ培養(yǎng)基中褐化嚴(yán)重。外植體的取材部位與天女木蘭的褐化程度密切相關(guān)，側(cè)芽褐化率相對(duì)較低，其次是頂芽，帶芽的莖段褐化率最高。在Ｂ５＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．３ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ培養(yǎng)基中添加適宜濃度的抗氧化劑、吸附劑有利于抑制天女木蘭的褐化，抗褐化效果是聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ）＞維生素C（VＣ）＞活性炭（ＡＣ）。用１ ｇ／Ｌ ＶＣ浸泡外植體４ ｈ可有效減輕褐化。培養(yǎng)初期一定的低溫和暗培養(yǎng)可以減輕天女木蘭的褐化。

關(guān)鍵詞：天女木蘭（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ Ｋ． Ｋｏｃｈ）；組織培養(yǎng)；抗褐化

中圖分類號(hào)：Ｓ７９２．９９；Ｑ９４３．１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）14－3107-03

Study on Browning Controlling of Magnolia sieboldii in Tissue Culture

ＷＡＮＧ Ｈｕａｎ１，２，ＤＵ Ｆｅｎｇ－ｇｕｏ２，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ－ｘｉａｎｇ１，ＱＩ Ｃｕｉ－ｃｕｉ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂ． ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｂｅｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ １３２０１３，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｐｒｏｂｌｅｍ of Ｍａｇｎｏｌｉａ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ Ｋ． Ｋｏｃｈ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｙｐｅ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｍｅｄｉｕｍ， ａｎｔｉ－ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂ５ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｕｌｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｗｅｌｌ ｗｈｉｌｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｗａｓ ｓｅｒｉｏｕｓ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ ｐｌａｙｅｄ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｂｒｏｗｎｉｎｇ． Ｔｈｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｌａｔｅｒａｌ ｂｕｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｕｄ； ａｎｄ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｂｕｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ． Ｓｏａｋｉｎｇ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｉｎ １ ｇ／Ｌ ＶＣ ｆｏｒ ４ ｈ ｃｏｕｌｄ ａｌｌｅｖｉａｔｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｔ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ Ｂ５＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．３ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ． Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｒａｎｋｅｄ ａｓ ＰＶＰ＞ＶＣ＞ＡＣ． Lｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｄａｒｋ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｒｅｌｉｅｖｅ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｐｒｏｂｌｅｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍａｇｎｏｌｉａ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ Ｋ． Ｋｏｃｈ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； anti ｂｒｏｗｎｉｎｇ

天女木蘭（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ Ｋ． Ｋｏｃｈ）又名天女花、小花木蘭，為木蘭科木蘭屬落葉小喬木，是第四紀(jì)冰川時(shí)期幸存的珍稀植物，是國家重點(diǎn)保護(hù)的易危植物和吉林省一級(jí)保護(hù)植物［１］，也是中國惟一分布于東北地區(qū)的木蘭科植物［２］。它集觀葉、觀花、觀果于一身，同時(shí)全株含有芳香油，可以被用于提取高級(jí)香料并具有很高的藥用價(jià)值。

目前，主要通過種子繁殖和扦插繁殖培育苗木，但種子繁殖存在采種難、生理休眠的問題，扦插繁殖存在生根慢及生根率低等問題［３－６］。運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)是建立天女木蘭無性繁殖的重要手段，不僅能有效解決種源欠缺的問題，而且還能保留母樹的優(yōu)良性狀，快速繁育良種。已有一些學(xué)者開展了天女木蘭的組織培養(yǎng)研究工作，但存在繁殖系數(shù)低、褐化及生根難等問題［７－９］。因此如何克服褐化成為天女木蘭組織培養(yǎng)快速繁殖成功與否的關(guān)鍵之一，而關(guān)于天女木蘭組織培養(yǎng)快速繁殖中的褐化問題研究較少。基于此，研究了外植體類型、外植體預(yù)處理方法、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)條件及抗褐化劑類型等對(duì)天女木蘭組織培養(yǎng)過程中外植體褐化的影響，以期為天女木蘭組織培養(yǎng)快速繁殖提供參考，對(duì)挽救和保護(hù)這個(gè)珍稀瀕危樹種也具有重要意義。

１材料與方法

１．１材料

試驗(yàn)材料為取自吉林市龍?zhí)秴^(qū)江密峰苗圃的８年生的長勢(shì)良好的天女木蘭實(shí)生苗，分別在３、４月初剪取天女木蘭當(dāng)年生健壯的休眠枝條，在室內(nèi)水培７～１０ ｄ，待芽萌動(dòng)膨大時(shí)再接種；在５～７月剪取天女木蘭新萌發(fā)的幼嫩枝條做試驗(yàn)。

１．２方法

采用單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理接１０瓶，重復(fù)３次。剪取帶芽的莖段、頂芽和側(cè)芽，放入洗潔精溶液中浸泡２０ ｍｉｎ，再用流水沖洗２ ｈ，然后在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)為７５％的乙醇對(duì)其表面消毒３０ ｓ，用無菌水沖洗２～３次，然后用１ ｇ／Ｌ ＨｇＣｌ２處理７～８ ｍｉｎ，用無菌水沖洗５～６次。將０．５～１．０ ｃｍ的芽或帶芽的莖段分別接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中。如無特殊說明，培養(yǎng)基中均附加３０ ｇ／Ｌ蔗糖和６ ｇ／Ｌ瓊脂，滅菌前ｐＨ ５．８，培養(yǎng)溫度為２３ ℃，光照采用自然光。分別在接種的７、１５、３０ ｄ觀察褐化率和外植體生長情況，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均是培養(yǎng)３０ ｄ的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。褐化率＝褐化外植體／接種外植體×１００％。

１．２．１不同培養(yǎng)基對(duì)天女木蘭褐化的影響設(shè)６個(gè)處理，所有培養(yǎng)基均添加０．５ ｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．３ ｇ／Ｌ ＩＢＡ。這６個(gè)處理分別為：①以ＭＳ為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加８ ｇ／Ｌ瓊脂；②以１／２ ＭＳ為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加８ ｇ／Ｌ瓊脂；③以Ｂ５為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加８ ｇ／Ｌ瓊脂；④以１／２ Ｂ５為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加８ ｇ／Ｌ瓊脂；⑤以Ｂ５為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加７ ｇ／Ｌ瓊脂；⑥以Ｂ５為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加６ ｇ／Ｌ瓊脂。研究不同培養(yǎng)基對(duì)天女木蘭褐化的影響。

１．２．２不同外植體對(duì)天女木蘭褐化的影響春季分別采用頂芽、帶芽的莖段、側(cè)芽３種外植體接種于培養(yǎng)基Ｂ５＋０．５ ｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．３ ｇ／Ｌ ＩＢＡ。研究不同外植體對(duì)天女木蘭褐化的影響。

１．２．３不同抗褐化劑對(duì)天女木蘭褐化的影響在培養(yǎng)基Ｂ５＋０．５ ｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．３ ｇ／Ｌ ＩＢＡ中添加０．５、１．０、２．０ ｇ／Ｌ聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ），０．２５、０．５０、１．００ ｇ／Ｌ維生素Ｃ（ＶＣ）和０．５、１．０、２．０ ｇ／Ｌ活性炭（ＡＣ）。研究不同抗褐化劑對(duì)天女木蘭褐化的影響。

１．２．４不同培養(yǎng)條件對(duì)天女木蘭褐化的影響設(shè)計(jì)３種培養(yǎng)條件：①接種后于１５ ℃暗培養(yǎng)７ ｄ，轉(zhuǎn)入２３ ℃于光下培養(yǎng)；②接種后于２３ ℃暗培養(yǎng)７ ｄ，轉(zhuǎn)入２３ ℃于光下培養(yǎng)；③接種后于２３ ℃光照培養(yǎng)，光照時(shí)間１２ ｈ／ｄ，７ ｄ后在２３ ℃、光照時(shí)間１２ ｈ／ｄ、光照度２ ０００～２ ５００ ｌｘ的培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。研究不同培養(yǎng)條件對(duì)天女木蘭褐化的影響。

１．２．５不同外植體預(yù)處理方法對(duì)天女木蘭褐化的影響將天女木蘭側(cè)芽分別在１ ｇ／Ｌ ＰＶＰ、１ ｇ／Ｌ ＶＣ以及清水中浸泡４ ｈ，然后接種到培養(yǎng)基Ｂ５＋０．５ ｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．３ ｇ／Ｌ ＩＢＡ上。研究不同外植體預(yù)處理方法對(duì)天女木蘭褐化的影響。

２結(jié)果與分析

２．１不同培養(yǎng)基對(duì)天女木蘭褐化的影響

從表１可知，培養(yǎng)基對(duì)外植體褐化和生長有明顯的影響。在６種培養(yǎng)基中，Ｂ５培養(yǎng)基對(duì)防止外植體褐化效果好，ＭＳ培養(yǎng)基中外植體褐化最為嚴(yán)重，褐化率達(dá)９０％。這可能是因?yàn)椋停优囵B(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高，尤其是ＮＨ４＋濃度高，易引起酚類物質(zhì)的大量產(chǎn)生，而鹽濃度過高又會(huì)增加酶的活性，酶進(jìn)一步促進(jìn)酚類物質(zhì)的合成與氧化，從而導(dǎo)致外植體的褐化。固體培養(yǎng)基中瓊脂濃度不同即培養(yǎng)基硬度不同，抑制褐化的效果有一定差異。培養(yǎng)基較稀時(shí)，酚類、醌類物質(zhì)容易滲入培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基變?yōu)楹稚?，同時(shí)使接觸它的外植體也變?yōu)楹稚?，褐化?yán)重；培養(yǎng)基硬度較高時(shí)，培養(yǎng)基基本不變色，外植體大多成綠色，褐化較輕。

２．２不同外植體對(duì)天女木蘭褐化的影響

外植體的取材部位與天女木蘭的褐化程度密切相關(guān)。從表２可知，側(cè)芽褐化率相對(duì)較低，為４０．０％；其次是頂芽，褐化率為４６．７％；帶芽的莖段褐化率最高，為６３．３％，且出現(xiàn)褐化的時(shí)間早?？赡苁怯捎谇o段切口面積大，使植物體內(nèi)酚類物質(zhì)大量流出，在多酚氧化酶（PPO）的作用下發(fā)生了氧化，使外植體易發(fā)生褐變。頂芽和側(cè)芽的褐化發(fā)生情況不同，可能是由于位置效應(yīng)影響了植物的生理狀態(tài)，頂芽的物質(zhì)代謝活躍，同時(shí)又由于不同位置內(nèi)源激素濃度不同，致使基因的表達(dá)不一致，從而形成不同的生長狀態(tài)。

２．３不同抗褐化劑對(duì)天女木蘭褐化的影響

在培養(yǎng)基Ｂ５＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．３ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ中添加適宜濃度的抗氧化劑、吸附劑等抗褐化劑有利于抑制天女木蘭的褐化。由表３可知，抗褐化效果是ＰＶＰ＞ＶＣ＞ＡＣ，其中吸附劑ＰＶＰ控制褐化的效果最好，且隨著ＰＶＰ濃度的升高，褐化率降低，試驗(yàn)得出添加１．０ ｇ／Ｌ ＰＶＰ時(shí)褐化率最低，為１０．０％，且外植體生長良好。抗氧化劑ＶＣ和吸附劑ＡＣ也能控制天女木蘭的褐化，隨著它們濃度的升高，褐化率均降低，但濃度過高會(huì)影響外植體的生長；ＶＣ濃度須控制在０．５０ ｇ／Ｌ以下，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長褐化明顯加重，須及時(shí)轉(zhuǎn)瓶；ＡＣ的抗褐化作用不明顯，但ＡＣ作為一種無選擇性的吸附劑，在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時(shí)還會(huì)吸附植物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)其濃度達(dá)到２．０ ｇ／Ｌ時(shí)，雖然褐化減輕但嚴(yán)重阻礙了外植體的生長。

２．４不同培養(yǎng)條件對(duì)天女木蘭褐化的影響

從表４可知，培養(yǎng)初期一定的低溫和暗培養(yǎng)可以減輕天女木蘭的褐化程度，這可能與低溫和黑暗條件抑制了酶的活性和減少了酚類物質(zhì)的氧化有關(guān)。暗培養(yǎng)對(duì)減輕褐化效果較明顯，而低溫對(duì)其影響不大。酚類物質(zhì)在合成和氧化過程中，需要許多酶的參與，其中有一部分酶的活性是受光誘導(dǎo)的，如ＰＰＯ在光照條件下活性提高。因此，暗培養(yǎng)可以抑制酶活性，從而減輕天女木蘭外植體的褐化程度。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，褐化現(xiàn)象也隨即產(chǎn)生，說明低溫和暗培養(yǎng)只能在短時(shí)間內(nèi)抑制了褐化物質(zhì)的產(chǎn)生。

２．５不同外植體預(yù)處理對(duì)天女木蘭褐化的影響

天女木蘭芽在接種前采用抗褐化劑浸泡４ ｈ，對(duì)抑制褐化有一定作用（表５）。兩種藥劑處理的褐化率均低于對(duì)照（清水）。用１ ｇ／Ｌ ＶＣ處理效果較好，褐化率為２０．０％，外植體長勢(shì)好；用１ ｇ／Ｌ ＰＶＰ處理的褐化率為３６．７％。

３小結(jié)與討論

選擇適宜的外植體是控制天女木蘭褐化的有效手段。因?yàn)椴煌课缓蜕頎顟B(tài)的外植體中酚類物質(zhì)的含量及多酚氧化酶（PPO）的活性存在差異。研究得出，以天女木蘭側(cè)芽為外植體，褐化程度較輕。這一結(jié)果和徐石等［９］的研究結(jié)果一致。

適宜的取材時(shí)間可減輕天女木蘭的褐化程度。由于在春季，天女木蘭植株體內(nèi)代謝活動(dòng)較弱，其細(xì)胞內(nèi)參與氧化反應(yīng)的PPO活性較低，因此，在這個(gè)季節(jié)取材褐化率較低；將取材時(shí)間設(shè)置為１２月至次年３月的冬芽萌動(dòng)時(shí)期，在一定程度上減少了星花木蘭等植株褐化的損失［１０］。周麗艷等［１１］在白玉蘭組織培養(yǎng)的褐化控制研究中也得出了同樣的結(jié)論。

培養(yǎng)基中添加抗氧化劑、吸附劑可減輕天女木蘭的褐化程度。研究得出，聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ）的抗褐化效果最好，其次是維生素Ｃ（ＶＣ），再次是活性炭（ＡＣ）。劉均利等［１２］在木蘭科華蓋木組織培養(yǎng)的褐化控制研究中也得出了同樣的結(jié)論。添加１ ｇ／Ｌ

ＰＶＰ，褐化率最低，為１０．０％，且促進(jìn)了外植體生長。隨著抗褐化劑濃度的升高，褐化情況有所緩解，但濃度過高會(huì)影響外植體生長，因此抗褐化劑的使用濃度要適中。而吸附劑則可吸附分泌到培養(yǎng)基中的酚類、醌類物質(zhì)，有效地防止此類物質(zhì)所誘發(fā)的褐變。

適宜的培養(yǎng)基可減輕天女木蘭的褐化程度。研究得出，Ｂ５培養(yǎng)基防止外植體褐化的效果最好。ＭＳ培養(yǎng)基抑制褐化效果最差，不適合作為天女木蘭組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基。不同培養(yǎng)基中鹽離子濃度差異較大，而鹽濃度過高會(huì)增加酶的活性，酶又進(jìn)一步促進(jìn)酚類物質(zhì)的合成與氧化；同時(shí)無機(jī)鹽中的Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋參與酚類物質(zhì)的合成，是氧化酶的組成成分或輔助因子，導(dǎo)致外植體的褐化。

適宜的培養(yǎng)條件能延緩天女木蘭的褐化，這可能是黑暗和低溫暫時(shí)降低了PPO的活性，在一定程度上降低了酚類物質(zhì)的氧化，但一旦恢復(fù)到正常的培養(yǎng)狀態(tài)，其活性也隨即恢復(fù)，又繼續(xù)進(jìn)行。在試驗(yàn)過程中，天女木蘭暗處理比光處理效果好，較高的培養(yǎng)溫度和光照度能加速外植體褐化。

綜上所述，以上單因素措施在一定程度上控制了天女木蘭的褐化程度，為了更好地控制天女木蘭的褐化程度，需要綜合采取多種抗褐化措施。

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