腸三葉因子對(duì)腸黏膜保護(hù)與修復(fù)的研究

章美元 綜述 韓 真* 審校

皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院消化內(nèi)科（241001）

三葉因子家族是近年研究較多的一群小分子多肽，具有黏膜保護(hù)、修復(fù)、抑制炎癥介質(zhì)反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和細(xì)胞凋亡等功能。目前已發(fā)現(xiàn)3種三葉肽，即乳癌相關(guān)肽（pS2/TFF1）、解痙多肽（SP/TFF2）和腸三葉因子（ITF/TFF3）。 其中ITF于1991年由Suemori等[1]首次在大鼠空腸發(fā)現(xiàn)，其既是腸道特異性黏膜修復(fù)因子，又是黏膜損傷的快速反應(yīng)肽。本文就ITF對(duì)腸黏膜保護(hù)與修復(fù)的研究作一綜述。

一、ITF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和性質(zhì)

ITF主要是由杯狀細(xì)胞分泌的特異分布于腸黏膜表面的多肽物質(zhì)。人ITF編碼基因定位于21號(hào)染色體長(zhǎng)臂（21q22.3）長(zhǎng)度為55 kb的片段中，并可連鎖表達(dá)[2]。ITF為含有59個(gè)氨基酸的單鏈多肽，分子質(zhì)量為6～7 kDa（1 Da=0.9921 u），同源序列約有38～39個(gè)氨基酸，包括保守和半保守的氨基酸。保守氨基酸中包含6個(gè)半胱氨酸殘基，形成三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，交聯(lián)方式為1-5、2-4、3-6，從而產(chǎn)生特征性三葉結(jié)構(gòu)。ITF的結(jié)構(gòu)保守，具有抗酸、抗蛋白酶和抗熱分解等特性。

ITF分布有較強(qiáng)的組織特異性和細(xì)胞特異性[3]。ITF主要在小腸、結(jié)腸和胃竇黏膜[4]中高表達(dá)，各段小腸中ITF含量差異不明顯[5]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)人食管黏膜下腺體（主要在Z線和胃賁門(mén)之間）可見(jiàn)ITF較高表達(dá)，在胰腺、唾液腺、淚腺、鼻黏膜、前列腺、子宮、乳腺、氣管、肺、下丘腦、垂體、海馬回[6]等組織中亦有低水平表達(dá)，此外ITF亦可在乳汁中表達(dá)，胎兒出生前后ITF表達(dá)不同[7,8]。

在病理狀態(tài)下，ITF表達(dá)發(fā)生明顯改變，分布缺乏組織專(zhuān)一性，在食管腸化生、胃食管反流病、胃潰瘍、腸道慢性炎癥以及腺瘤、腺癌等中均有表達(dá)。Kadri等[9]發(fā)現(xiàn)ITF在Barrett食管（BE）而非鄰近組織中高表達(dá)，有望成為BE非內(nèi)鏡檢查的標(biāo)記物。ITF表達(dá)與結(jié)腸腫瘤預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)增高提示預(yù)后不良[10]。ITF在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和肝癌組織中亦有表達(dá)。Vestergaard等[11]報(bào)道前列腺癌患者血漿ITF濃度增加，但其是否可作為預(yù)測(cè)前列腺癌的指標(biāo)，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。ITF在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并與肝細(xì)胞癌分級(jí)有關(guān)[12]。ITF在腫瘤中的高表達(dá)與其功能密切相關(guān)，同時(shí)進(jìn)一步證明TFF的生理作用是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。

二、ITF的黏膜保護(hù)機(jī)制

1.與黏蛋白的結(jié)合：整個(gè)胃腸道不斷受到各種理化、生物因素的侵襲，需一套有效的機(jī)制來(lái)維護(hù)黏膜完整性并及時(shí)修復(fù)損傷的黏膜。ITF和黏蛋白由相同的杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，損傷發(fā)生時(shí)兩者的表達(dá)同時(shí)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)ITF與黏蛋白結(jié)合時(shí)保護(hù)作用增強(qiáng)[13]。ITF分子的空間結(jié)構(gòu)中有一大小為0.8～1 pm的間隙能特異性地與黏蛋白的側(cè)鏈結(jié)合，對(duì)黏蛋白的分子結(jié)構(gòu)起支架作用，且其結(jié)合位點(diǎn)可隨黏蛋白的側(cè)鏈不同而進(jìn)行調(diào)整。兩者結(jié)合后，形成凝膠復(fù)合物，起穩(wěn)定黏液層的作用，能阻止多種蛋白酶以及機(jī)械應(yīng)力等因素造成的腸黏膜損傷。此外，兩者之間還存在互相作用的機(jī)制，如黏蛋白可使腸上皮細(xì)胞表面ITF結(jié)合蛋白表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)ITF與腸上皮細(xì)胞的結(jié)合[14]。ITF可通過(guò)二硫鍵與黏蛋白相互交聯(lián)，形成黏彈性的黏液凝膠層，且在應(yīng)用ITF后明顯增加可溶性黏液的分泌量并增加其黏度。實(shí)驗(yàn)[15]證實(shí)ITF具有保護(hù)黏膜的作用，其對(duì)黏膜保護(hù)作用的機(jī)制為穩(wěn)定黏液層以及刺激上皮細(xì)胞在損傷處的修復(fù)[16]。

2.參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，降低炎癥反應(yīng)：ITF不僅參與黏液屏障的組成，還通過(guò)阻止腸道炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)胃腸黏膜。研究[17]報(bào)道ITF通過(guò)抑制單核細(xì)胞iNOS/NO調(diào)節(jié)結(jié)腸炎NO介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Teng等[18]給予結(jié)腸炎小鼠注射rhITF，結(jié)果顯示腸道損害減輕，炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF）-α、Toll樣受體 4（TLR4）、NF-κB表達(dá)降低，其機(jī)制可能為 ITF可阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路。盡管ITF在免疫反應(yīng)中起一定作用，其并不是直接通過(guò)樹(shù)突細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)由脂多糖（LPS）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[19]，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3.抗細(xì)胞凋亡作用：ITF抗凋亡信號(hào)系統(tǒng)目前尚不完全清楚。細(xì)胞凋亡對(duì)確保正常發(fā)育、生長(zhǎng)以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要的作用，凋亡過(guò)程由復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控，并受到相關(guān)細(xì)胞因子影響。目前認(rèn)為凋亡主要有兩條調(diào)節(jié)途徑：①線粒體通路（內(nèi)源性途徑）：該通路的活化由促凋亡因子如BAX和BAK以及抑制因子Bcl-2和Bcl-xl之間的平衡所調(diào)節(jié)，p53是這一過(guò)程重要的調(diào)節(jié)分子；②細(xì)胞表面死亡受體通路（外源性途徑）：細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)與攜帶凋亡信號(hào)的專(zhuān)一性配體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如Fas/FasL凋亡途徑。上述兩條通路最終均激活caspase，進(jìn)而執(zhí)行細(xì)胞凋亡。Taupin等[20]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ITF缺失小鼠的結(jié)腸細(xì)胞凋亡增加且不伴隨Fas或Bcl家族表達(dá)的改變；高表達(dá)ITF的結(jié)腸細(xì)胞株（HT-ITF1）能抵抗由神經(jīng)酰胺和血清饑餓誘發(fā)的細(xì)胞凋亡；外源性ITF可保護(hù)人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞株HCT-116和IEC-6細(xì)胞凋亡；且這種作用可被酪氨酸磷酸化抑制劑A25所抑制，提示其可能與磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）活化有關(guān)。AGS胃癌細(xì)胞中p53依賴的細(xì)胞凋亡可被C末端未發(fā)生剪切突變的ITF所抑制，且PI3K和EGFR須功能良好。由此可見(jiàn)，ITF是內(nèi)源性胃腸道具有抗凋亡特性的肽類(lèi)物質(zhì)。ITF能促進(jìn)IEC-18細(xì)胞[21]和SW837結(jié)腸癌細(xì)胞[22]中轉(zhuǎn)染表達(dá)人類(lèi)ITF載體NF-κB p50/p65異源二聚體的活性，且能增強(qiáng)IEC-18細(xì)胞的抗凋亡能力，此外，NF-κB阻斷劑能顯著降低ITF誘導(dǎo)的IEC-18細(xì)胞的抗凋亡能力，推測(cè)ITF能通過(guò)NF-κB途徑增強(qiáng)IEC-18的抗凋亡能力。ITF的抗凋亡作用可能是其在腫瘤和IBD等疾病中的重要作用機(jī)制之一，需進(jìn)一步研究探討。

三、ITF的黏膜修復(fù)機(jī)制

1.促進(jìn)腸上皮細(xì)胞移行：黏膜上皮細(xì)胞損傷后早期修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是細(xì)胞遷移，即損傷區(qū)域周邊的細(xì)胞遷移到損傷區(qū)，重建上皮的完整性并重組黏膜屏障[15,23]。上皮細(xì)胞間通過(guò)位于側(cè)膜上的連接復(fù)合體而相互黏附，這種連接復(fù)合體由三種咬合在一起的成分組成：緊密連接、黏附連接以及橋粒[24,25]。緊密連接由多種蛋白質(zhì)參與形成，主要包括閉鎖蛋白（occludin）、閉合蛋白（claudin）、閉鎖小帶（zona occludens,ZO）、連接黏附分子等。黏附連接發(fā)生在相鄰細(xì)胞的鈣黏蛋白（cadherin）分子之間，由Ca2+介導(dǎo)。如緊密連接或黏附連接等發(fā)生破壞或功能改變，即發(fā)生細(xì)胞遷移。ITF在體內(nèi)外均能促進(jìn)多種細(xì)胞的遷移，可能與 APC蛋白、β-catenin、E-cadherin、EGFR復(fù)合體、ERK等關(guān)系密切。研究[26]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)需轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β介導(dǎo)，而ITF對(duì)上皮的修復(fù)作用不依賴TGF-β，其通過(guò)促進(jìn)損傷周?chē)?xì)胞遷移到破損處進(jìn)行精密修復(fù)。ITF通過(guò)上皮細(xì)胞cadherin降低細(xì)胞間連接，促進(jìn)細(xì)胞移行。上皮細(xì)胞cadherin是相對(duì)分子質(zhì)量為12000的跨膜蛋白，其細(xì)胞外部分介導(dǎo)細(xì)胞間的緊密連接，細(xì)胞內(nèi)部分通過(guò)catenin與細(xì)胞骨架的微絲系統(tǒng)相連。ITF通過(guò)影響上皮細(xì)胞間catenin的表達(dá)和定位，以及誘導(dǎo)catenin的酪氨酸磷酸化，從而降低細(xì)胞間的緊密連接，促進(jìn)上皮細(xì)胞移行。ITF促進(jìn)腸上皮細(xì)胞移行還涉及Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并與EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)。ITF可能通過(guò)酪氨酸或雙異磷酸酶活性調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信息通道，抑制ERK和MAPK的部分通道。ITF可直接刺激ERK磷酸化，而不經(jīng)EGF受體磷酸化，既不需要完整的三葉基序，又無(wú)需二聚化而可完成促進(jìn)細(xì)胞移行的作用。目前對(duì)ITF是否促進(jìn)上皮細(xì)胞分化尚不清楚。有研究[13]表明ITF的修復(fù)作用需杯狀細(xì)胞的分化、成熟以及其與黏蛋白的組裝和分泌。

目前ITF介導(dǎo)修復(fù)的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未完全清楚。Kalabis等[27]通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Vangl1在接受ITF刺激后發(fā)生Ser/Thr磷酸化，減少了細(xì)胞膜間E-cadherin的連接，促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合。因而Vangl1可能是介導(dǎo)ITF修復(fù)小腸黏膜的效應(yīng)器。

2.促進(jìn)血管增殖，與EGF協(xié)同增效：黏膜重建還需豐富的黏膜血流供應(yīng)，ITF和其他相關(guān)生長(zhǎng)因子可促進(jìn)血管生成[28]，從而促進(jìn)黏膜修復(fù)。ITF與EGF在多種損傷模型中發(fā)揮協(xié)同增效的作用，EGF引起的離子遷移亦有調(diào)節(jié)作用。在各種不同的細(xì)胞株中，給予ITF后，EGF受體和ErbB-2發(fā)生磷酸化[29]。目前尚未證實(shí)ITF與EGFR有直接的聯(lián)系，推測(cè)EGFR可能發(fā)生一種間接的轉(zhuǎn)活。

3.與受體作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖：ITF可能通過(guò)與其受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮修復(fù)黏膜的功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[30]中小劑量皮下給藥即可顯示ITF的保護(hù)功能，說(shuō)明可能存在三葉肽特異性受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。但目前尚缺乏明確的證據(jù)。有研究[31]推測(cè)PDZD2可能與ITF密切相關(guān)，其受體可能是具有PDZ結(jié)構(gòu)域或類(lèi)似PDZ結(jié)構(gòu)域的一種新蛋白。ITF與PDZD結(jié)合后，使PDZD2蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，暴露PDZ結(jié)構(gòu)域，從而與Vangl1結(jié)合，通過(guò)Ser/Thr磷酸化，使其失去結(jié)合Dsh的能力，解除Vangl1對(duì)Dsh的抑制作用，從而使Wnt信號(hào)能順利向下游傳遞，發(fā)揮促細(xì)胞移行的作用。Wnt8b、ITIH4可能是ITF受體的候選蛋白，有待進(jìn)一步篩選研究。

四、ITF與IBD關(guān)系

IBD病因不明確，可能與遺傳、環(huán)境、感染和免疫均有關(guān)，細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程，是當(dāng)前研究IBD發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)之一。TNF-α等細(xì)胞因子在IBD發(fā)病中的作用已得到公認(rèn)，但其釋放和調(diào)控機(jī)制尚不明確，近年集中于TLRs/NF-κB通路，而研究[17]表明ITF可阻斷該通路，且外源性給予、局部給予和促內(nèi)源性增加ITF，均能使黏膜凝膠的穩(wěn)定性提高，促進(jìn)黏膜損傷愈合，加快修復(fù)。ITF的促進(jìn)黏膜愈合作用[32]，可能使其成為治療IBD的新方案。

五、結(jié)語(yǔ)

ITF作為一種新的胃腸黏膜保護(hù)因子，目前其作用受到廣泛重視。其既能與黏蛋白結(jié)合形成凝膠，增強(qiáng)黏膜防御功能，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞移行，加速損傷修復(fù)，保持腸黏膜完整，從而減輕電解質(zhì)丟失和免疫所致的腸道炎癥反應(yīng)；同時(shí)有具有抗酸、耐酶以及熱分解的生物學(xué)特性，從而有望成為預(yù)防和治療IBD的一種新途徑。但目前仍應(yīng)進(jìn)一步闡明ITF多肽分子的功能，鑒定其受體或結(jié)合蛋白，并闡明各級(jí)信號(hào)通路。

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